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  Responsable : CRAINIC Radu (craira@pasteur.fr)


  resume

 

Nos recherches concernent les virus à ARN positif et notamment les entérovirus et le virus de l'hépatite C (VHC). Nous étudions la variabilité génétique des entérovirus et, en particulier, les mécanismes de la recombinaison génétique naturelle du Poliovirus. Sur la base de la découverte d'une corrélations entre des motifs sérologiques et génomiques, nous avons développé un procédé de "sérotypage" moléculaire des Entérovirus. Nous avons mis en évidence, isolé, visualisé et caractérisé la nucléocapside du VHC circulante dans le sang des infectés chroniques



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1. Variabilité et évolution des entérovirus (R. Crainic, F. Delpeyroux)

Les Entérovirus humains (picornaviridae ; 64 sérotypes) sont des virus à transmission digestive, responsables de nombreuses pathologies aiguës (paralysie de type poliomyélitique, encéphalites ou conjonctivites hémorragiques) et, probablement aussi, chroniques (myocardiopathie dilatée, diabète). Le poliovirus, l'agent pathogène de la poliomyélite, est un entérovirus neurotrope dont il existe 3 sérotypes (1, 2 et 3). Deux vaccins sont utilisés actuellement pour prévenir la poliomyélite : le vaccin injectable à virus inactivé (VPI) et le vaccin oral à virus atténué (VPO). Seul le VPO induit une immunité digestive durable, capable de stopper la transmission de poliovirus sauvage.
La plasticité génétique des virus à ARN, due aux mutations et à la recombinaison génétique, est à la base de la diversité et de l'évolution virale et entraîne l'apparition de nouvelles souches pathogènes et épidémiogènes. C'est grâce à cette plasticité que les souches atténuées du VPO peuvent, suite à la multiplication chez les enfants vaccinés, acquérir un caractère neuropathogène et provoquer des cas de poliomyélite paralytique associée à la vaccination (PPAV). Récemment, suite à l'acquisition simultanée de caractères pathogènes et de transmissibilité, un poliovirus vaccinal a provoqué en République Dominicaine et à Haïti une véritable épidémie de poliomyélite .

Recombinaison génétique naturelle chez le poliovirus (S. Guillot, N. Cuervo, V. Caro, F. Delpeyroux, R. Crainic)

La recombinaison génétique entre les poliovirus du VPO apparaît favorisée par la multiplication simultanée des trois souches de sérotype différent du VPO chez les vaccinés. En effet, nos études ont montré que prés de 3/4 de la centaine de souches isolées chez des PPAV était recombinantes. Parmi celles-ci, six se sont avérées porter des séquences atypiques. Une de ces séquences provenait d'un poliovirus sauvage; les autres provenaient probablement d'autres entérovirus non-polio. Nous avons également trouvé des souches de poliovirus sauvages portant des séquences dérivées de souches du VPO. Ces résultats indiquent que les échanges génétiques avec les souches sauvages de PV, et peut-être d'entérovirus non-polio, constituent un mode d'évolution privilégié du poliovirus. L'évolution des autres entérovirus s'effectue probablement par des échanges fréquents intra- et inter-spécifiques de matériel génétique.
L'étude des nombreuses souches recombinantes intertypiques isolées chez des primo-vaccinés sains avec du VPO nous a permis de constater que la recombinaison génétique semble obéir à des règles strictes; en effet, la caractérisation des génomes issus de la recombinaison révèle l'existence d'associations génomiques et de régions de recombinaison préférentielles. Ceci suggère que des facteurs agissant au cours de la réplication et, probablement aussi, de la sélection chez l'hôte déterminent les caractéristiques des génomes recombinants.

Taxonomie moléculaire des Entérovirus (V. Caro, S. Guillot, R. Crainic)

Dans le but de mettre en évidence une éventuelle corrélation entre la structure génomique et la pathologie provoquée par les Entérovirus, nous avons initié et coordonné un projet de recherche en collaboration internationale sur leur taxonomie moléculaire. En effectuant une analyse extensive de la structure génomique des souches de référence, nous avons découvert une corrélation entre la séquence nucléotidique d'un fragment de gène codant pour la protéine de capside VP1, portant les sites antigéniques de neutralisation, et leur structure antigénique, qui gère leur classification sérologique
Un couple d'amorces a été développés qui permet de tester, par transcription inverse et amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR), pratiquement toutes les souches de références. La comparaison des séquences nucléotidique des amplicons obtenus à partir de ces souches et quelques souches de terrain nous a permis de découvrir une parfaite corrélation entre la structure génomique du fragment analysé leur spécificité antigénique le sérotype. L' alignement et le traitement des séquences nous a permit de découvrir une parfaite corrélation entre la structure antigénique du virus et la séquence du segment génomique que nous avons choisi, le tiers 3' du gène codant pour la protéine de capside VP1. Il est devenu ainsi possible de classer les virus en fonction de leur sérotype en utilisant un outil moléculaire d'identification, ce qui a ouvert la voie d'un "sérotypage moléculaire" des entérovirus.

Phylogénie des Entérovirus épidémiogènes (A. Szendroï, S. Chevaliez, J. Balanant, F. Delpeyroux).

Dans le but d'aborder l'évolution d'autres types d'entérovirus nous avons entamé l'étude comparative de souches d'echovirus 11, virus capable d'entraîner des infections néonatales sévères. Des isolats hongrois provenant de nouveau-nés décédés d'un syndrome hémorragique lors d'une épidémie en 1989 ont été comparés avec des souches isolées en Europe, dans la même période, dans des contextes non épidémiques. Les souches épidémiques montrent une remarquable homogénéité nucléotidique et protéique (99% d'homologie), indiquant qu'elle dérive d'un ancêtre commun récent et, curieusement, apparaissent très proches, d'un point de vue génétique, de deux souches qui ont circulé dans des pays voisins à la même période, en dehors de toute épidémie. Ces deux souches proviennent l'une de l'environnement et l'autre d'un cas isolé d'hémiparèse. Les caractères génétiques et phénotypiques qui différencient ces diverses souches font actuellement l'objet d'une étude détaillée.


2. Physiopathologie de l'infection par le Virus de l'Hépatite C (VHC)(A. Budkowska, P. Maillard, M. Sidorkiewicz, A. Poujol)

L'infection par le VHC représente un des problèmes majeurs de santé publique en France et dans le monde. L'évolution fréquente de la maladie vers la chronicité, dans 80% des cas, est à l'origine du développement de cirrhoses hépatiques et de cancers primitifs du foie. Il n'existe actuellement aucun moyen de prévention ou de traitement efficace de la maladie. Nos connaissances sur les fonctions et les propriétés des protéines structurales du VHC reposent uniquement sur des données moléculaires et des modèles d'expression in vitro. La structure et les propriétés biologiques des particules virales circulant dans le sérum des sujets infectés restent inconnues.
Nous avons démontré que des particules virales ayant les propriétés physico-chimiques, antigéniques et morphologiques de nucléocapsides non-enveloppées de VHC circulent librement dans le sérum de sujets infectés par le VHC. Ces particules virales ont une densité 1.32-1.34 g/ml en CsCl, un diamètre de 38-43 ou 54-62 nm au microscope électronique et expriment à leur surface des épitopes localisés dans la région immuno-dominante de la protéine C (aminoacides 24-66). Les nucléocapsides non-enveloppées, purifiées à partir de sérum, ont été utilisées pour la production des anticorps monoclonaux. Dans les études immuno-morphologiques ces nouveaux anticorps ont permis de démontrer l'accumulation de l'antigène de la nucléocapside dans le cytoplasme des hépatocytes, à la phase précoce de l'infection expérimentale de chimpanzés par immunofluorescence et microscopie confocale (coll. avec CDC. Atlanta, USA) .
La nucléocapside circulante est la seule particule virale du VHC isolée et caractérisée à ce jour. La production de nucléocapsides non-enveloppées et leur libération dans le sérum semble être une caractéristique de la morphogenèse du VHC. La présence de ces particules dans le sérum ainsi que leur accumulation dans les hépatocytes au cours de l'infection pourrait contribuer à l'induction de la persistance du VHC et aux multiples effets immuno-pathologiques observés au cours de l'infection par ce virus.

3. Recherche et activité de support à la Santé Publique (S. Guillot, J. Balanant, P. Maillard, A. Budkowska, F. Delpeyroux, R. Crainic)

L'activité de recherche et de support à la Santé Publique est formalisé par les structures fonctionnant dans le cadre du Laboratoire:
- le Centre Collaborateur OMS pour la Recherche et la Référence sur la Poliomyélite;
- le Centre Collaborateur OMS pour la Standardisation des Vaccins Viraux
- le "Groupe d'étude des Entérovirus" (F. Delpeyroux) basé sur de laboratoire de virologie du Réseau international des Instituts Pasteur et Instituts Associés impliqués notamment dans la recherche sur la poliomyélite
- le Laboratoire de Référence Régional (Europe) et Laboratoire Spécialisé (global, à coté de CDC Atlanta, KTL Helsinki, RIVM Bilthoven, NIBSC Londres et NIID Tokyo) du Réseau Mondial des Laboratoires Polio de l'OMS pour l'éradication de la Poliomyélite
- Coordination des Groupes d'Etude en Collaboration Internationale Inco-Copernicus sur le poliovirus (Radu Crainic) et sur le VHC (Agata Budkowska) et financé par l'Union Européenne.
 
Une partie de la recherche présentée dans les chapitres précédents est le résultat de travaux réalisés dans le cadre de ces collaborations internationales.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
   

BUDKOWSKA Agata , Dr.Sci. IP, (abudkow@pasteur.fr)

CRAINIC Radu, Dr.Med, Dr.Sci. IP, (craira@pasteur.fr)

DELPEYROUX Francis, Dr.Sci. INSERM, (delpeyro@pasteur.fr)

CARO Valérie , Thèse (vcaro@pasteur.fr)

CHEVALIEZ Stéphane, Pharmacien, DEA > Thèse (scheval@pasteur.fr)

CUERVO Nancy, Thèse, (ncuervo@pasteur.fr)

OPRISAN Gabriela, Chercheur, Réseau IP (Bucarest) (molepi@cantacuzino.ro)

OTELEA Dan, Chercheur, Réseau IP (Bucarest) (dotelea@cantacuzino.ro)

POUJOL Aurélie, stagiaire de recherche

SAMOILOVICH Elena, post-doctorant (Minsk) (esamoil@briem.ac.by)

SIDORKIEWICZ Malgorzata, post-doctorant (Varsovie)

BALANANT Jean, Ing. IP, (jbalanan@pasteur.fr)

GUILLOT Sophie, TS. IP, (sguillot@pasteur.fr)

MAILLARD Patrick, TS, IP, (pmaillar@pasteur.fr)

GUIOT Colette, Aide Lab., IP


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