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  Responsable : BARZU Octavian (obarzu@pasteur.fr)


  resume

 

L'activité de recherche a été concentrée en priorité sur les nucléoside monophosphate (NMP) kinases bactériennes. Essentielles à la division, la croissance ou le métabolisme cellulaire, ces enzymes représentent des cibles potentielles dans la thérapie antibactérienne. Une autre vocation du laboratoire a été l'application de la spectrométrie de masse et de l'électrophorèse bidimensionnelle à l'étude du protéome de divers organismes. Depuis décembre 2000, cette activité a intégré la Génopole de l'Institut Pasteur sous l'appellation de Plateau Technique 3, " Protéomique ".



  rapport

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1. NMP kinases de Mycobacterium tuberculosis
(H. Munier-Lehmann en collaboration avec G. Labesse et S. Pochet)

Deux des cinq NMP kinases de M. tuberculosis ont été plus particulièrement étudiées cette année : la TMP kinase et l'UMP kinase. Une approche de type " drug design " a été développée sur la TMP kinase à partir d'un modèle structural de l'enzyme de M. tuberculosis. Ce modèle a été élaboré à l'aide des structures des TMP kinases d'Escherichia coli et de levure, résolues par cristallographie (Lavie et al. 1997, 1998). Ainsi, trois positions sur le dTMP ont été retenues pour la conception d'analogues. La position 2 de l'hétérocycle a été dans un premier temps choisie. Une dizaine de composés ont été synthétisés et testés en tant que substrat ou inhibiteur de l'enzyme recombinant purifié. L'un de ces analogues est un inhibiteur compétitif à des concentrations de l'ordre de 10-6 M. Nos résultats mettent aussi en évidence une affinité très semblable du nucléotide et du nucléoside correspondant pour la TMP kinase de M. tuberculosis. Cette observation ouvre de nouvelles perspectives dans l'obtention d'inhibiteurs spécifiques appartenant à la famille des nucléosides. Par greffage de divers groupes fonctionnels sur le sucre en position 5' nous envisageons d'augmenter la vitesse de passage des analogues à travers les membranes.
L'UMP kinase est une autre cible de choix : l'enzyme bactérien, spécifique de l'UMP, est un héxamère régulé par l'UTP et le GTP, alors que son homologue eucaryote est un monomère possédant la capacité de phosphoryler l'UMP et le CMP. A ce jour, aucune structure d'UMP kinase bactérienne n'a encore été résolue. L'enzyme de M. tuberculosis a été surproduit chez E. coli sous forme d'une protéine fusion avec une séquence étiquette du coté N-terminal, composée de six résidus histidine en alternance avec six résidus asparagine. Cette séquence supplémentaire n'affecte pas les propriétés de l'enzyme et a permis de le purifier en une seule étape. L'UMP kinase de M. tuberculosis est stable et soluble (jusqu'à 14 mg/ml), contrairement à l'enzyme d'E. coli, insoluble au dessus de 0,1 mg/ml. Récemment, des cristaux ont été obtenus en collaboration avec B. Gomes Guimaraes et P. Alzari (Unité de Biochimie Structurale). D'autre part, un dérivé lourd d'UTP a été synthétisé, afin d'accélérer la résolution de la structure.


2. CMP kinase d'E. coli
(L. Assairi, A.-M. Gilles, H. Munier-Lehmann, A. Ofiteru en collaboration avec T. Bertrand, P. Briozzo et J. Gallay)

Afin de comprendre le mécanisme de reconnaissance du CMP et du dCMP, propre aux CMP kinases bactériennes, la structure de l'enzyme d'E. coli en complexe avec ces deux substrats ainsi qu'avec le b-arabinosyl CMP et le didésoxy CMP, a été résolue par cristallographie aux rayons X. Ces structures mettent en évidence la contribution des groupements 2'OH et 3'OH du pentose dans le mouvement de certains domaines de l'enzyme, induit par la fixation du ligand. La substitution, par mutagenèse dirigée, des résidus Arg181 et Asp185 qui interagissent directement avec le 3'OH du pentose, diminue considérablement la phosphorylation du CMP et du dCMP. La substitution de la Ser101 qui forme une liaison hydrogène avec l'Asp185 en présence de CMP et de dCMP, affecte modérément la phosphorylation du premier nucléotide mais altère de façon dramatique la phosphorylation du dCMP. La Ser101 est le seul résidu strictement conservé parmi les 40 acides aminés qui constituent le domaine INSERT, spécifique aux CMP kinases bactériennes. L'étude par fluorescence résolue en temps de la conformation et de la dynamique du site ATP, a montré que l'anthraniloyl-2'-dATP une fois lié à la protéine est protégé du milieu aqueux grâce au mouvement d'un domaine appelé LID qui vient recouvrir le site de fixation du nucléotide donneur de phosphate.


3. UMP kinase d'autres espèces bactériennes (L. Assairi, T. Borza, C. Gagyi, A.-M. Gilles en collaboration avec N. Bucurenci et M. Straut)

Le clonage et la surproduction d'enzyme appartenant à différents genres bactériens (Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis, pour les bactéries Gram- ; Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae, pour les bactéries Gram+) ont été entrepris. Toutes ces protéines sont solubles mais instables en absence d'UTP.
L'analyse biochimique montre une différence notable entre les deux genres de bactéries, à savoir, le besoin quasi absolu de GTP comme activateur de l'enzyme des bactéries Gram + mais pas de l'enzyme de bactéries Gram -.


4. NAD kinase de Neisseria meningitidis(L. Assairi)

La NAD kinase est une nucléotide kinase qui produit le NADP à partir d'ATP. C'est un enzyme essentiel chez les procaryotes et les eucaryotes, étant donné le rôle du NADP dans de nombreuses réactions cellulaires. Nos objectifs sont l'étude structurale et du mécanisme catalytique, l'analyse des sites de reconnaissance de l'ATP et du NAD et la recherche d'inhibiteurs. Nous avons cloné par PCR le gène de la NAD kinase de N. meningitidis à partir de l'ADN génomique et surproduit la protéine en utilisant plusieurs vecteurs d'expression. Nous avons choisi, la forme portant une séquence riche en His à l'extrémité C-terminale car plus soluble et active. La caractérisation de la NAD kinase est actuellement en cours.

5. Identification et caractérisation de protéines de fonction inconnue (L. Assairi, T. Borza, J.Ferdinand, C. Gagyi, A.-M. Gilles en collaboration avecC.T. Craescu, S. Burlacu-Miron et J. Neuhard)

Nous avons entrepris l'étude d'une protéine d'E. coli de structure et de fonction inconnue, isolée par chromatographie de pseudo-affinité et identifiée après électrophorèse bidimensionnelle et spectrométrie de masse. Cette protéine monomérique de 18,2 kD (YajQ) a été marquée uniformément en 15N et/ou en 13C. Sa structure secondaire vient d'être résolue par RMN homo- et hétéronucléaire. Nos résultats suggèrent une structure capable de fixer l'ARN simple brin. Nous avons poursuivi l'étude d'un cluster de quatre gènes présent uniquement chez les Salmonelles et codant respectivement une permease (DeoP), la deoxyribokinase (dRK), un répresseur (DeoQ) et une protéine de fonction inconnue (OrfX). Le répresseur DeoQ régule la synthèse de DeoP, dRK et OrfX (opéron deoK). Il est intéressant de mentionner que DeoR, represseur qui agit sur l'opéron deoCABD, agit aussi sur l'opéron deoK, mais la réciproque n'est pas vraie. Les protéines DeoQ et OrfX ont été surproduites et caractérisées. Des cristaux d'OrfX, que nous supposons agir comme un transporteur soluble de sucres, ont été récemment obtenus.


6. Electrophorèse bidimensionnelle(C. Laurent-Winter)

L'analyse globale de protéomes bactériens en collaboration avec plusieurs unités du campus a été poursuivie plus particulièrement sur les microorganismes pathogènes. Chez Vibrio Cholerae, une quinzaine de protéines dont l'expression est régulée par le pH et/ou la protéine VicH, analogue d'H-NS, ont été identifiées (Régulation de l'Expression Génétique). L'analyse d'un mutant de Staphylococcus aureus, altéré dans un système de régulation à deux composants, a permis de sélectionner une dizaine de protéines comme cibles potentielles du gène régulateur muté (Biochimie Microbienne). Une dizaine de protéines ont été identifiées chez M. tuberculosis, comme cibles potentielles d'un activateur de transcription de la famille d'AraC dont l'activité est essentielle à la virulence (Génétique Mycobactérienne). Enfin, chez la levure encapsulée, Crypotococcus neoformans, l'électrophorèse bidimensionnelle, associée aux techniques de transfert et d'immunoempreinte ont permis d'identifier une protéine de 40 kDa, impliquée dans la réponse humorale des animaux survivant à l'infection cryptococcique (Mycologie).


7. Spectrométrie de masseNamane, J.-C. Rousselle)

Au cours de l'année 2000, plus de 800 analyses qui se répartissent par moitié dans l'identification des protéines et pour l'autre moitié dans la caractérisation des protéines ont été réalisées. L'identification des protéines à partir de gels d'électrophorèse est atteinte pour une sensibilité située entre 100 fentomoles et 1 picomole. Dans le cadre du Programme Transversal de Recherche " Glycosylation d'épitopes immunodominants de M. tuberculosis " (G. Marchal), nous avons identifié, à partir de gels d'électrophorèse bidimensionnelle, seize protéines exportées et potentiellement glycosylées, parmi lesquelles six ne sont pas connues. En collaboration avec l'Unité des Interactions Moléculaires (A. Jacquier), nous avons identifié par spectrometrie de masse vingt protéines appartenant aux ribosomes de levure. Parmi celles-ci seize appartiennent à la petite sous-unité ribosomale de la mitochondrie et n'avaient pas été décrites auparavant



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LAMBRECHT Marie-Régine

Bârzu Octavian, Directeur de Recherche CNRS

Gilles Anne-Marie, Chef de laboratoire, IP

Munier-Lehmann Hélène, Chargée de Recherche, INSERM

Portnoï Denis, Chargé de Recherche, IP

Assairi Liliane, Chargée de Recherche, CNRS

Borza Tudor, Chercheur post-doctoral, (départ le 1er août 2000), Faculté de Biologie, Université "Babes- Bolyai" Cluj-Napoca, Roumanie.

Gagyi Elena, Assistant, Université de Médecine et de Pharmacie, Cluj-Napoca, Roumanie.

Ferdinand Joëlle, Stagiaire DEA.

Lecointe Gwénaël, Stagiaire, (départ le 31 août 2000).

Ofiteru Augustin, Chercheur en cours de thèse, Institut Cantacuzène, Bucarest Roumanie.

Pistotnik Elisabeth Stagiaire DEA, (départ le 30 septembre 2000).

Laurent-Winter Christine, Ingénieur, IP

Namane Abdelkader Ingénieur Technologue, IP

Rousselle Jean-Claude, Ingénieur Technologue, IP

Sakamoto Hiroshi, Ingénieur IP, (départ le 17 avril 2000)


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