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  Responsable : MILON Geneviève (gmilon@pasteur.fr)


  resume

 

Dans notre Unité sont analysés et caractérisés, à l'échelle tissulaire, cellulaire et subcellulaire, les nombreux processus biologiques qui rendent compte des interactions durables  que des parasites eucaryotes, les leishmanies, établissent avec (a) des organismes hôtes (la souris,un hôte expérimental voire d'autres rongeurs adaptés à la captivité et l'homme) et/ou (b) des  leucocytes hôtes. Ces analyses sont menées aussi bien dans le contexte de la compréhension des processus pathogènes, de leur prévention que dans le contexte, trop négligé, de la transmission des leishmanies de l'hôte mammifère à l'hôte diptère hématophage, le phlébotome.



  rapport

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Préambule.


Ont été définis des modèles reposant sur la disponibilité de souris de laboratoire pour analyser, in vivo, ex vivo les processus transitoires ou durables asymptomatiques et/ou pathogènes qui se développent (1a) au niveau du site sous-cutané et surtout au niveau du site intradermique de délivrance de promastigotes de Leishmania spp, (1b) dans le ganglion drainant, (1c) dans des sites distants du site d'inoculation, p.e rate et autres sites cutanés. Toutes ces analyses in vivo, ex vivo sont alimentées par des études, in vitro,  réalisées avec des leucocytes phagocytaires mononucléés de souris, (2a) biogénèse et caractérisation de la vacuole parasitophore au sein de laquelle des promastigotes invasifs  se différencient en amastigotes puis se multiplient ou pas, (2b) présence, ou absence, au niveau de leur membrane des ( 2b1) ligands des récepteurs clonotypiques des lymphocytes T, (2b2) de molécules de co-stimulation des lymphocytes T, (2c) synthèse de cytokines/chimiokines voire d'autres médiateurs non protéiques, (2d) présence de récepteurs  pour des molécules solubles ou transmembranaires. Dans la mesure où l'un des modèles les plus étudiés " Leishmania major/souris de laboratoire génétiquement différentes " est considéré comme un modèle de référence pour établir quelle est la combinaison de signaux membranaires et solubles qui, in vivo , dans le ganglion drainant, rend compte de la " programmation stable " de type 1 ou de type 2  de lymphocytes CD4 réactifs à des peptides parasitaires, permettez-nous de dégager différents éléments de ce modèle  et de préciser pourquoi nous avons jugé essentiel de définir d'autres modèles que nous estimons plus pertinents. Quels sont donc les éléments du modèle considéré comme " modèle de référence " qui méritent une attention critique ? Sont inoculés, par voie sous-cutanée et en très grand nombre, des promastigotes récoltés à la phase stationnaire de développement in vitro. Un tel inoculum  contient très peu de  promastigotes métacycliques. Or les promastigotes métacycliques sont des stades de développement — invasifs pour l'hôte mammifère - qu'atteignent les parasites, chez leurs hôtes naturels hématophages, les phlébotomes. Leurs propriétés invasives, après délivrance intradermique -le site naturel d'inoculation - se traduisent  (1) par  les propriétés suivantes : (1a) internalisation rapide   par des macrophages non-activés, (1b)   différenciation  en amastigotes, au sein d'une vacuole parasitophore dont ils induisent le remodelage, (1c) multiplication des amastigotes et  (2) par le fait que, pendant leur phase de différenciation en amastigotes puis leur multiplication  strictement intracellulaire, les parasites détournent des mécanismes homéostatiques du système immunitaire de leur hôte qui leur permettent d'augmenter leur effectif dans le derme, voire d'atteindre des sites distants cutanés ou non cutanés par exemple le  foie, la rate, la moelle osseuse, trois tissus qui surveillent l'homéostasie du compartiment sanguin.


1. Poursuite de l'exploration de paramètres immunologiques dans le contexte du modèle  de référence  ,reposant sur la  délivrance, dans le coussinet plantaire, d' un nombre élevé d'une population de parasites  non ou peu enrichis en promastigotes métacycliques/invasifs.

1.1. Est-il possible de  modifier la  programmation de lymphocytes T, réactifs à L.major , en délivrant des bactéries, L.monocytogenes, vectrices du gène lack, un gène commun à toutes les espèces de Leishmania(
J.-H. Colle ®1/10/00, E. Fontan , H . Saklani, G. Milon .- N. Glaichenhaus, Nice ,- P.Goossens ®1/05/00).

Des souris ont été  immunisées avec L.monocytogenes, vectrice  du gène lack (LACK-LM). Le gène lack spécifie la synthèse d'une protéine parasitaire LACK (Leishmania homologue of receptors for Activated C Kinase). Ont été comparées deux voies de délivrance des bactéries - la voie intrapéritonéale et la voie intragastrique - et a été exploré l'impact du nombre d'immunisations, ce chez des souris de deux lignées, les souris  BALB/C et les souris B10/D2, des souris qualifiées respectivement comme des sensibles et résistantes à L.major. Cette étude a  permis d'établir qu'après inoculation de LACK -LM, des lymphocytes  CD4 réactifs au peptide de LACK affins pour IAd et synthétisant de l'interféron g, sont détectables dans les organes lymphoïdes secondaires atteints par ces vecteurs bactériens. Des lymphocytes CD4 activés  lors de cette immunisation et programmés dans la voie de type 1 (i.e. qui synthétisent de l'interféron g) créent dans le ganglion drainant un micro-environnement favorable à la différencation de lymphocytes de type 1. La présence de ces lymphocytes T se traduit par l'absence ou un retard du développement des lésions dans le coussinet plantaire où sont inoculés des promastigotes récoltés à la phase stationnaire de croissance, ce chez les souris des deux lignées. Cette étude a également permis d'établir que la culture de L. monocytogenes à pH acide confère à l'inoculum bactérien la propriété de résister au pH acide de la lumière gastrique, un processus qui permet aux bactéries de transiter jusqu'au compartiment caeco-colique puis d'atteindre les tissus extra-intestinaux (ganglions mésentériques, rate, foie ). En l'absence de  TNFa
, la translocation des bactéries vers les tissus extra-intestinaux est accentuée et le processus infectieux, évalué par la charge bactérienne dans de nombreux tissus, n'est pas contrôlé.

1.2. Comment, dans les temps précoces, se traduit la présence de promastigotes peu ou pas invasifs de Leishmania major dans un inoculum, d'effectif élevé, délivré par voie sous-cutanée à des souris de fond génétique différent ? (F. Tacchini-Cottier, J. Louis  : Centre collaborateur OMS, Institut de Biochimie, Lausanne ; K.. Soteriadou : Institut Pasteur, Athènes, G. Milon).

Après inoculation sous-cutanée de doses élévées de promastigotes  peu ou non enrichis en métacycliques, le site qui a été le plus exploré a été essentiellement le ganglion lymphatique drainant. Dans ce tissu, outre la " polarisation " des lymphocytes T CD4 ont   été plus récemment étudiés le recrutement et les fonctions régulatrices de neutrophiles. Des lymphocytes T CD4 Vß 4 Va8 contenant des transcrits d'IL4 ont été détectés dès la seizième heure après l'inoculation de L major (> 2.106) chez la souris BALB/c (P. Launois, J. Louis). Ces auteurs ont  établi la nature du ligand parasitaire auquel sont réactifs les récepteurs clonotypiques de ces lymphocytes CD4 : il s'agit d'un peptide,  dérivé de la protéine LACK, affin pour IAd. Dans notre Unité, E. Prina, N. Courret, J.-C. Antoine ont pu établir que ce ligand est généré uniquement quand des macrophages - induits à exprimer des molécules de classe II du Complexe Majeur d'Histo-compatibilité (CMH) - ont phagocyté des promastigotes non invasifs. Dans le ganglion drainant des souris BALB/c, l'activation de cette sous -population de  lymphocytes T CD4, la présence de neutrophiles et le moindre nombre de cellules NK contribuent à créer un environnement cytokinique dominé par de l'interleukine 4 : en l'absence d'interleukine 12 et d'interféron g ceci se traduit par la différenciation de lymphocytes CD4 naïfs - réactifs à d'autres peptides parasitaires non encore identifiés - dans la voie de type 2. Des métabolites (par exemple la transferrine plus ou moins chargée en fer) que peuvent lier aussi bien les macrophages hôtes que les leishmanies intracellulaires peuvent aussi interférer avec la polarisation des lymphocytes T CD4 réactifs à d'autres peptides parasitaires.


2. Leishmania du complexe donovani : localisation et caractérisation des sous-populations de leucocytes phagocytaires mononucléés qui les hébergent au niveau de la rate (T. Lang, P. Ave, M. Huerre, G. Milon, J.-C. Antoine).

Parmi les organes (foie, rate, moelle osseuse) qui surveillent l'homéostasie du compartiment vasculaire sanguin, la rate mérite une attention particulière dans la mesure où les parasites qui l'atteignent - soit sous forme d'amastigotes isolés, soit sous forme de leucocytes parasités — peuvent se distribuer soit dans des macrophages de la zone marginale, soit dans des macrophages de la pulpe rouge, soit dans des macrophages Siglec 1 positifs, voire dans des leucocytes dendritiques immatures périsinusoïdaux. Lors d'une première analyse (Leclercq et al., J.Immunol., 1996, 157, 4537-4545), nous avons établi que L. infantum (complexe donovani) utilisait des macrophages Siglec 1 positifs du stroma de la moelle osseuse. L'étude en cours a permis d'établir que des amastigotes se distribuent en effet dans différentes sous-populations de macrophages dans la pulpe rouge, la pulpe blanche et dans la zone marginale. Pour la majorité d'entre eux, sur la base des propriétés de la vacuole parasitophore et de leur membrane (présence de molécules de classe II du CMH, protéases…), il est plausible que ces macrophages puissent ré-activer des lymphocytes T CD4 et donc être cibles des cytokines que ces derniers sécrètent.


3. Définition d'un modèle de parasitisme avec Leishmania amazonensis reposant sur la disponibilité d'une colonie de Proechimys oris, un hôte naturel de ce parasite présent en Amérique du Sud (E. Prina, K. Sebastien, P. Bastien — UMR CNRS 5093, P. Ave, M. Huerre, J.-C. Antoine).

En 1998, grâce à des collègues de la Faculté de Pharmacie de Châtenay-Malabry (J.-C. Ganthier et al.), une colonie de Proechimys oris adaptés aux conditions de captivité a été mise à notre disposition et est désormais maintenue à l'Institut Pasteur. Dès que les conditions de manipulation, d'anesthésie ont été soigneusement définies, il a été possible de suivre le devenir d'un inoculum d'amastigotes de L. amazonensis (isolat récolté il y a très longtemps et isolat récolté très récemment) après leur délivrance dans le coussinet plantaire. Les premiers phénotypes perceptibles (présence de lésions très transitoires, voire parasitisme aysmptomatique) vont être précisés ; au terme de cette seconde série d'analyses, la collaboration mise en place avec Petr Volf (voir plus loin) devrait permettre de cribler si les tissus cutanés glabres (coussinet plantaire, oreille…) sont des niches tissulaires où persistent des amastigotes transmissibles aux vecteurs Lutzomiya longipalpis


4. Mise au point de modèles originaux — que nous estimons plus pertinents - pour caractériser, à l'échelle moléculaire, cellulaire et tissulaire, les processus pathogènes plus ou moins durables puis les processus de cicatrisation qu'induisent des promastigotes métacycliques de L. major et de L. amazonensis.

4.1. La caractérisation et la purification d'espèces moléculaires de la membrane d'amastigotes de Leishmania du complexe mexicana
(E. Fontan, T. Ilg : Tübingen, E. Handman  : Melbourne, J.-C. Antoine).

Comme il vient d'être précisé, chez l'hôte mammifère, les promastigotes métacycliques des leishmanies se différencient en amastigotes, ce au sein d'une vacuole parasitophore dont la biogenèse et le remodelage témoignent probablement à la fois (i) du caractère " réplicatif " ou non des amastigotes et (ii) du niveau d'activation/dé-activation des leucocytes phagocytaires mononucléés qui les abritent. Curieusement, peu de molécules uniques au stade " amastigote " sont identifiées. Aussi, l'anticorps monoclonal (2A3-26) criblé sur la base de sa liaison uniquement à des amastigotes viables (non fixés, non perméabilisés) de Leishmania du complexe mexicana est-il précieux comme réactif pour purifier une ou des espèces moléculaires membranaires d'amastigotes. Actuellement, il a été établi que les espèces moléculaires glycosylées de haut poids moléculaire qui lie 2A3-26 sont différentes des protéophosphoglycanes. Leur purification et leurs propriétés vont bénéficier de la plateforme 3 (Protéomique) au sein de la Génopole I.P.

4.2. Comparaison des propriétés invasives des promastigotes méta-cycliques de L. major et de L. amazonensis : étude avec des macrophages de souris BALB/C générés in vitro à partir de précurseurs médullaires réactifs au CSF-1 et exposés ou non à de très faibles doses d'interféron g(N. Courret, C. Frehel : INSERM 411 Hôpital Necker, N. Gounier et M. Pouchelet INSERM, T. Lang, E. Prina, J.-C. Antoine).

Après qu'aient été mises au point des méthodes reproductibles d'enrichissement en promastigotes métacycliques des deux espèces, il a été établi que ces stades de développement sont rapidement phagocytés par les macrophages. Au sein de phagosomes qui, initialement ont épousé la forme des promastigotes, les parasites se différencient en amastigotes. Les propriétés des amastigotes de L. amazonensis, au sein de la vacuole parasitophore, ont été plus particulièrement caractérisées 48 heures après la phagocytose : présence du compartiment subcellulaire de type mégasome, présence de cystéine-protéases, présence d'une protéine de membrane détectée par l'anticorps 2A3-26 (voir plus loin), présence de leishmaniolysine mégasomale. En outre, dès la 24ème heure, des molécules de classe II du CMH de la membrane de la vacuole parasitophore sont dégradées par les parasites, une propriété qui avait été initialement établie pour des amastigotes matures qui se multipliaient.

4.3. Des modèles qui permettent d'analyser l'impact  du  caractère plus ou moins invasif de L. major  et/ou de l'espèce de leishmanie sur la réactivité des lymphocytes T CD4  recrutés/retenus dans le ganglion drainant  (N. Courret, J.-H. Colle ®1/10/00, T. Lang, N. Glaichenhaus : Nice, D. Sacks : NIH Bethesda , E. Prina, G. Milon et J.-C. Antoine).

Ces modèles reposent sur l'utilisation de souris BALB/C auxquelles sont inoculés, dans le derme de l'oreille, de 103 à 106 parasites (L.major)  dont le caractère invasif est variable : (1) invasivité très faible - promastigotes récoltés à la phase exponentielle de croissance, (2) invasivité faible - promastigotes récoltés à la phase stationnaire de croissance, (3) invasivité plus conséquente inoculum enrichi en promastigotes métacycliques. Les premiers signes cliniques sont d'autant plus rapidement détectables que les parasites inoculés sont invasifs. Il a été possible d'estimer que l'inoculum préparé à partir de populations parasitaires récoltées à la phase exponentielle de croissance contient de l'ordre d'1 parasite invasif pour 1.000 parasites non invasifs donc rapidement tués et dégradés par les macrophages qui les ont phagocytés. Dans le ganglion drainant la production précoce (mais seulement à partir de trois jours) de cytokines (Interferon g et/ ou IL4 ) révélées in vitro par la ré-activation des lymphocytes T CD4 par LACK est d' autant plus importante que les promastigotes inoculés sont peu invasifs. Il n'a pas encore été possible de caractériser les leucocytes qui, dans le ganglion, activent - voire reprogramment - les lymphocytes T réactifs à LACK.

4.4. Un modèle de leishmaniose cutanée murine  pour décrypter des mécanismes pathogènes puis de guérison spontanée des  leishmanioses cutanées humaines  d'où sont isolées L. major : de nouvelles perspectives pour des interventions mieux ciblées (J.-H. Colle ®1/10/00, M. Lebastard, -Y. Belkaid, D. Sacks  : NIH, Bethesda,  G. Milon).

L'analyse du cycle de vie de Leishmania spp ,dans les conditions naturelles, a permis de réveler les points suivants : Leishmania major circule entre un diptère femelle le phlébotome  et des rongeurs. L'association des phlébotomes  avec les rongeurs est à deux niveaux : (1) leurs larves terricoles se développent dans leurs galeries - un biotope où elles trouvent leur nourriture et (2) les femelles adultes prennent leur repas sanguin au niveau des parties glabres (p.e. pavillon auriculaire, nez ,...) de ces rongeurs. Si L.major est présente dans des sites où cohabitent phlébotomes et rongeurs, chez certaines femelles des promastigotes métacycliques se sont développés : ils peuvent être inoculés dans le derme des sites glabres, le plus fréquemment l'oreille ; bien qu'il reste difficile d'établir quel est le nombre de parasites inoculés, il est estimé que l'effectif délivré dans le derme superficiel est entre 10 et 1.000 promastigotes métacycliques, ce en présence de molécules de la salive, voire de molécules d'origine extracellulaire parasitaire (protéoglycanes) et d'autres tissus du vecteur (intestin moyen). En l'absence d'une colonie de phlébotomes (Phlebotomus papatasi), certaines de ces observations ont tout de même pu être prises en compte pour proposer et établir un nouveau modèle : de faibles doses(de 10 à 1.000) de promastigotes métacycliques de L. major (l'isolat NIH 173 ou l'isolat Friedlin qui a été choisi pour le projet séquençage du génome de Leishmania) sont inoculés dans le derme de l'oreille de souris C57BL/6 ou B1OD2. Puis les trois  sites interconnectés que sont l'épiderme, le derme, le ganglion lymphatique drainant sont explorés chaque semaine pour différents paramètres. Au niveau du derme et du ganglion lymphatique drainant est estimée la charge parasitaire, au niveau de l'épiderme, du derme et du ganglion lymphatique drainant sont explorables les transcrits de cytokines chimiokines de molécules adhésives, le trafic des leucocytes de quatre lignages:leucocytes dendritiques, leucocytes phagocytaires mononucléés, voire neutrophiles, éosinophiles et lymphocytes T CD4 et  CD8. Seront enfin explorables les leucocytes adhérents à la matrice extracellulaire comme les macrophages, les mastocytes, voire les précurseurs des éosinophiles. Il a été possible d'établir l'existence de plusieurs phases discrètes qui sont précieuses pour ré-explorer ce qui détermine la diversité des interactions qu'établit L.major chez l'homme (processus pathogènes, guérison " spontanée ou non, processus parasitaires asymptomatiques).

5. Un modèle pour décrypter et caractériser les mécanismes - hôtes et parasites dépendants - de transmission des amastigotes de l'hôte mammifère à l'hôte phlébotome(J.-H. Colle ®1/10/00, M.. Lebastard, L. Nicolas, P. Volf : Charles University Prague, G. Milon).

Ce modèle a été établi pour mieux appréhender une étape clé du cycle de tout parasite, i.e. ce qui détermine leur transmission d'hôte à hôte, donc ce qui contribue à leur pérennité. Ainsi disposons-nous désormais d'un modèle avec lequel étudier (1) les propriétés des tissus cutanés où persiste une population stable (de l'ordre de 1000 parasites/oreille) d'amastigotes intracellulaires. Deux sites retiennent notre attention : (1) l'oreille où ont été initalement inoculés les promastigotes métacycliques, (2) l'oreille contralatérale où des parasites s'établissent entre la deuxième et la troisième semaine et ce pendant douze à treize semaines. Plusieurs hypothèses ont été formulées  et vont être criblées pour caractériser les mécanismes qui sous-tendent l'initiation du programme de développement " amastigotes transmissibles " et qui le maintiennent.



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