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  Responsable : Guy BORDENAVE (gbordena@pasteur.fr)


  resume

 

Les cellules du système immunitaire (lymphocytes (L)T, LB), entretiennent, lors de leurs fréquents contacts, de multiples et complexes communications. Les récepteurs cellulaires sollicités émettent alors des signaux qui transfèrent l'information à l'intérieur des cellules incriminées. La réaction appropriée est, à ce moment-là, provoquée. Nous avons développé des systèmes qui permettent de mimer certaines de ces interactions et d'étudier les mécanismes biochimiques et génétiques qui régissent ces relations.



  rapport

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L'activation des lymphocytes T en présence de cyclosporine A (CSA) induit l'expression d'un nouveau programme génétique (Laurent Mascarell et Paolo Truffa-Bachi)

La découverte des propriétés immunosuppressives de la cyclosporine A (CSA) ainsi que son utilisation en transplantation d'organes sont des avancées fondamentales en santé publique. Le complexe CSA-cyclophilines se lie à la calcineurine et inhibe l'activité phosphatase de cette enzyme. Le composé cytosolique du facteur nucléaire d'activation des lymphocytes T (NFAT) n'est plus déphosphoré par la calcineurine et n'est plus exporté vers le noyau. L'ensemble des gènes, tel l'IL2, possédant des régions régulatrices liant NFAT n'est alors plus transcrit. Néanmoins la CSA ne bloque pas l'induction d'AP-1, un autre transactivateur. Nous avons donc émis l'hypothèse que la CSA n'interférait pas avec l'expression de gènes régulés par AP-1 et que l'activation des lymphocytes T (LT) en présence de cet immunosuppresseur modifiait la transcription de l'ensemble des gènes inductibles.

Nous avons utilisé l'approche protéomique en analysant les nouvelles synthèses protéiques par incorporation de méthionine marquée au soufre S-35. Une collaboration a été établie entre notre groupe et celui du Dr Leftkovitz du " Basel Institute for Immunology ", devenu le " Roche Center for Medical Genomics ". L'analyse par le protéome n'est pas restreinte à l'analyse de quelques produits cellulaires, mais permet une mesure qualitative et quantitative de plusieurs centaines de protéines durant un intervalle de temps donné et reflète ainsi la transcription et la traduction potentielles des cellules sous diverses conditions. Le profil comparatif des gels en deux dimensions des cellules T activées à différents temps, en présence et en absence de CSA, montre que certains polypeptides ne sont synthétisés que chez les cellules activées et que de nombreuses protéines sont aussi communes chez les deux groupes de cellules activées, ce qui était attendu. Le fait que des polypeptides soient synthétisés uniquement en présence de la CSA justifie notre hypothèse.

Les conséquences de l'élimination de la CSA n'a pas fait l'objet d'une grande attention en dépit du fait qu'une interruption du traitement immunosuppresseur conduise à un rejet rapide de la greffe. C'est pourquoi nous avons étudié les effets de l'élimination de la CSA sur la synthèse protéique par une analyse protéomique. Nous avons trouvé qu'environ 80 polypeptides étaient synthétisés de novo suite à l'élimination de la CSA. Les nombreux changements dans la représentation polypeptidique confirment que les LT activés en présence de CSA acquièrent un nouveau programme d'activation génique.

En conclusion nous avons démontré que la CSA modifiait le programme génétique d'activation des LT. Bien que les LT activés en présence de l'immunosuppresseur ne prolifèrent pas, ils se différencient en cellules qui expriment à leur surface des marqueurs impliqués dans la coopération cellulaire et la migration. La découverte que la CSA induit la synthèse de nombreuses protéines qui ne se retrouvent ni chez les cellules au repos ni chez les cellules activées indique que l'immunosuppresseur doit agir au niveau d'une classe de transactivateurs qui régulent l'expression des gènes correspondants. Il reste encore à élucider si ce changement de représentation polypeptidique conduit la cellule vers des fonctions de différenciation connues ou si la modification du profil protéique dirige la cellule vers de nouvelles caractéristiques homéostatiques.


Une molécule d'origine végétale, l'agglutinine de la grande ortie, agit comme un superantigène sur les lymphocytes T de souris (Paula Rovira et Paolo Truffa-Bachi).

Bien que les fonctions physiologiques des lectines végétales soient peu connues, ces protéines sont de puissants outils dans l'analyse de l'activation des LT. Parmi les nombreuses lectines étudiées au laboratoire, nous avons trouvé que l'une d'entre elles, l'agglutinine de la grande ortie (UDA), était un superantigène activant la sous-population Vb8.3 des LT murins. La capacité de présentation par des molécules du complexe d'histocompatibilité de classe I et II (CMH I et CMH II) font de l'UDA un superantigène unique. De plus, nous avons démontré que la liaison entre UDA, CMH et TCR était liée à la reconnaissance des oligosaccharides portés par ces deux dernières molécules. La structure tertiaire de l'UDA a été réalisée en collaboration avec le groupe du Dr Graham Bentley dans notre département. Des cristaux d'UDA libre ou complexés à des oligosaccharides ont été obtenus et leur structure déterminée. Ces structures donnent une explication moléculaire de l'action de l'UDA en tant que superantigène. La chaîne Vb8.3 possède un résidu glycane dans une position unique par rapport aux autres chaînes Vß qui permet la liaison simultanée de l'UDA au TCR et au CMH. Ces contacts spécifiques sont responsables de l'activation et la prolifération des LT.


Etude des interactions de lipopolysaccharides (LPS) provenant de différents genres bactériens, se développant dans divers biotopes, avec les cellules du système immunitaire. (groupe dirigé par Robert Girard).

Introduction.

La connaissance des premières étapes d'interaction du LPS avec les cellules du système immunitaire, et d'autres tissus (système épithélial pulmonaire, intestinal) constitue un enjeu majeur dans la compréhension des nombreux effets pléiotropes, (le choc septique, souvent mortel, en est la manifestation la plus dramatique) déclenchés par ces molécules amphiphiles. Nous avons montré que des LPS de différentes souches bactériennes (notamment Salmonella enterica subsp. enterica et Bordetella spp.) pouvaient induire, à la surface des granulocytes de moelle osseuse d'homme ou de souris, l'expression de récepteurs très affins pour le lipide A. Ces récepteurs, identifiés comme étant le CD14, présentent une spécificité très large vis à vis de nombreux constituants bactériens comme les LPS, les peptidoglycanes, les lipophosphoglycanes, et sont distincts des récepteurs constitutifs. Ce phénomène d'induction est sous le contrôle du locus lps situé sur le chromosone 4 de la souris. Récemment, l'équipe de Beutler a décrit la séquence d'un gène situé à ce locus, codant une protéine transmembranaire appelée TLR4 appartenant à la famille des Toll-like-receptors (TLRs).Dans le cadre de notre observation initiale nous avons poursuivi l'étude du (ou des) récepteur(s) constitutif(s) au LPS et des voies de transduction des signaux impliqués dans l'expression du CD14 à la surface des granulocytes de moelle osseuse de souris.

Récepteur(s) constitutif(s) au(x) LPS.

Antérieurement nous avions montré que l'interaction du LPS avec des récepteurs exprimés à la surface des granulocytes de moelle osseuse était inhibée par le glycolipide de synthèse PPDm2. Cette interaction spécifique est réversible, saturable, temps et température dépendante. Avec le nouveau composé PPDm2-B, analogue de synthèse du lipide A, préparé par le groupe de R. CHABY, inhibant spécifiquement le phénomène d'induction du CD14, il nous a été possible d'obtenir un nouveau produit photoactivable et radiomarquable à 125 I. Avec ce réactif, des expériences de marquage par photo-affinité des cytoplastes de cellules de moelle osseuse exprimant le marqueur Ly6-G ont été réalisées. Des analyses en SDS-PAGE, et gel en 2 D,ont révélé que plusieurs protéines (d'environ 70, 30, 20 Kda) étaient radiomarquées, et que ce marquage était inhibé, partiellement, en présence de LPS. Par passage sur un gradient de saccharose la protéine 30Kda est enrichie dans une fraction de densité 1,12g/cm3. Cette protéine de 30Kda est également présente dans les membranes des cytoplastes préparés à partir des souris non répondeuses au LPS. Il est intéressant de noter que la masse moléculaire de cette protéine est équivalente à celle de la molécule MD-2 récemment décrite, qui en association avec TLR4 constituerait le détecteur du LPS pour certaines lignées de macrophages de souris. L'identification précise de ces molécules radiomarquées devrait permettre de définir la constitution du récepteur au LPS présent à la surface des granulocytes de moelle osseuse de souris et d'envisager une étude comparée avec les récepteurs présents sur des cellules plus différenciées ou sur des types cellulaires différents (lymphocytes B et pré-B).

Nos résultats expérimentaux ont montré que les LPS provenant de Rhizobium spp. pouvaient induire l'expression de CD14 à la surface des granulocytes de moelle osseuse provenant de lignées de souris non sensibles. Cette observation indique que le locus lps n'est pas impliqué et que probablement d'autres TLR, que TLR4, peuvent intervenir dans la détection de lipide A ayant des structures atypiques.

Signaux de transduction impliqués lors de l'induction du CD14.

Précédemment nous avions montré que le phénomène d'induction par le LPS du CD14 impliquait l'intervention de protéine tyrosine kinase et de la MAP kinase p38 mais non de la protéine kinase C. Cependant d'autres sérine/thréonine protéines kinases doivent intervenir comme l'indique la chute de la réponse des granulocytes au LPS obtenue avec les inhibiteurs K252a et KT.5823 de cette catégorie de kinases. Nous montrons que le pré-traitement des granulocytes de moelle osseuse par le phorbol myristate acétate (PMA) bloque totalement l'induction du CD14 par le LPS. L'absence de modification de la fixation du LPS radiomarqué sur ces cellules pré-traitées par le PMA nous indique que le phorbol ester déclenche un événement biochimique qui suit l'interaction du LPS et de son récepteur constitutif. L'observation qu'un activateur spécifique de l'isoforme PKC-a mime l'effet inhibiteur du PMA, alors qu'un inhibiteur spécifique de cette isoforme antagonise cet effet suggère un rôle régulateur de la PKC-a dans cette voie de signalisation déclenchée par le LPS.


Mécanismes cellulaires et moléculaires, chez la souris, de la suppression, induite au moyen de lymphocytes T, de l'expression de l'IgG2ab, et de la tolérance immunitaire des lymphocytes T à son égard (groupe dirigé par Guy Bordenave).

Introduction

Nous avons antérieurement montré que les souris de l'haplotype allotypique Igha (prototype : souris BALB/c) possédaient une fonction intrinsèque de LT contre l'expression de l'IgG2ab c'est-à-dire contre l'IgG2a de l'haplotype allotypique Ighb (prototype : souris C57Bl/6). On peut amplifier in vivo cette activité anti-IgG2ab de LT chez les souris Igha par ce que nous appelons la sensibilisation et qui consiste en l'injection, par voie veineuse, de LB de souris Ighb congéniques. Avec ces LT sensibilisés injectés à des nouveau-nés Igha/b ou Ighb/b (préparés par croisement de lignées Igh congéniques et donc histocompatibles) on induit une suppression totale, chronique (mais expérimentalement réversible) et spécifique de l'IgG2ab (chez 100 % des receveurs). Les autres allotypes, dont l' IgG2aa, et isotypes d'immunoglobulines continuent d'être normalement exprimés ce qui indique que cette suppression agit en aval de l'exclusion allélique et de la commutation isotypique qui conduisent aux plasmocytes producteurs d' IgG2ab. Ce dispositif expérimental in vivo, grâce auquel on peut interrompre ou faire reprendre, en quelque sorte à volonté, la production de grandes quantités d'une immunoglobuline, nous a permis et continue de nous permettre une dissection fine des partenaires (LT, LB) qui entrent en jeu dans une régulation négative au sein du système immunitaire. Depuis plus récemment il nous autorise également l'abord de problèmes qui relèvent de la tolérance immunitaire.

Nous avons, en particulier, montré que l'induction de cette suppression était sous la dépendance des deux sous-populations de LT : les LT CD4+ et les LT CD8+ qui ont à possèder l'activité anti- IgG2ab. Cependant, seuls les LT CD8+ paraissent indispensables au maintien de cette suppression. Au cours de l'amplification, chez les souris Igha, des LT anti-IgG2ab, on note que le recrutement des LT cytotoxiques CD8+ est tributaire des LT CD4+ amplificateurs.

Role de la molécule CD40 de la surface cellulaire dans la suppression de l'expression de l' IgG2ab.

Cette sujétion, c'est-à-dire la nécessité de l'aide de LT CD4+ pour engendrer des LT CD8+ cytotoxiques anti-IgG2ab nous a offert l'opportunité de tester le modèle "d'interactions cellulaires séquentielles" qui peut régir les rapports entre LT CD4+, LT CD8+ et cellules dendritiques (CD). Les LT CD4+ activés par un antigène induiraient la maturation des CD via l'interaction du constituant de surface CD40 présent sur les CD et le ligand de ce CD40 présent sur les LT CD4+ activés. Cette maturation conférerait aux CD la capacité à stimuler les LT CD8+ spécifiques dudit antigène et à les conduire à l'état d'effecteurs cytotoxiques. Par exemple, en l'absence de LT CD4+, leur effet amplificateur auprès des LT CD8+ pourrait être remplacé par l'action agoniste d'un anticorps anti-CD40. Nous nous sommes demandé si des souris Igha appauvries en LT CD4+, soumises in vivo à un traitement agoniste anti-CD40 et bien sûr sensibilisées contre des LB provenant de souris Ighb congéniques étaient capables de recruter des LT CD8+ régulateurs avec la potentialité d'inhiber la production d' IgG2ab chez des receveurs Igha/b. Nous avons observé que de telles souris étaient parfaitement aptes à développer in vivo une activité amplifiée de LT CD8+ anti-IgG2ab, tandis que celles qui ne subissaient pas le traitement agoniste anti-CD40 en étaient incapables. Néanmoins, en dépit de leur aptitude significative à moduler négativement la production d' IgG2ab, les LT CD8+ anti-IgG2ab recrutés au cours d'une stimulation par un anticorps anti-CD40 agoniste chez des souris Igha appauvries en LT CD4+ n'induisent pas une suppression totale chez tous les receveurs Igha/b comme on y parvient aisément avec les LT anti- IgG2ab CD8+ suscités en présence de LT CD4+ Ce remplacement incomplet, pour la stimulation des LT cytotoxiques CD8+, de l'effet auxiliaire des LT CD4+ par celui d'un anticorps agoniste anti-CD40 pourrait refléter la nécessité d'une stimulation parallèle des CD qui serait indépendante du constituant membranaire CD40 ou d'une communication directe entre LT CD4+ et LT CD8+. Il est toutefois évident que nos résultats montrent qu'un traitement agoniste anti-CD40 aboutit au recrutement de LT CD8+ cytotoxiques engagés dans des fonctions de régulation immunitaire.

Nous avons aussi précédemment montré que la lyse des LB IgG2ab+ cibles, par les LT anti-IgG2ab, mettait en jeu alternativement ou simultanément la perforine et un composé de la surface cellulaire appelé Fas. Nous savons, grâce à l'emploi de souris Igha invalidées pour le gène de la perforine, qu'on peut provoquer cette lyse par la seule voie de cytotoxicité du composé Fas. Or, il est connu, que les LB matures n'expriment pas de molécule Fas à leur surface. Sa présence est pourtant nécessaire à une cytolyse s'opérant par son truchement. Sa régulation à la surface des LB matures est sous la dépendance de la stimulation du CD40 par son ligand CD40-L. Notre modèle expérimental fournit aussi par conséquent la possibilité de tester l'intervention de l'expression de CD40 sur les LB IgG2ab+ quand les LT CD8+ effecteurs, de souris Igha, agissent exclusivement par la voie de mort cellulaire impliquant Fas. Nous avons établi (en utilisant des souris invalidées pour la perforine : Pfp-/-, qui n'empruntent donc que la voie Fas pour lyser leurs cibles et des souris Ighb invalidées pour le constituant CD40 : CD40-/-) que les LT de souris Igha Pfp-/- n'établissaient qu'une suppression partielle de l'expression de l' IgG2ab chez les LB de souris Ighb CD40-/- tandis qu'ils réalisaient une suppression totale chez les LB de souris Ighb CD40+/+. On peut imaginer qu'il existe deux sortes de LB produisant l'IgG2ab : i) une population très représentée qui régule le constituant Fas par un procédé indépendant de CD40 et qui est donc très susceptible à la suppression induite par l'intermédiaire de Fas ; ii) une population plus modestement représentée qui a besoin que l'expression du constituant Fas soit amplifiée à la surface cellulaire par l'intermédiaire de l'interaction CD40, CD40-L pour être sujette à la suppression. Ceci a fourni la première démonstration de l'intervention de la molécule CD40 dans une régulation négative au sein du système immunitaire.

Dans un autre ordre d'idée, nous avons aussi observé que le transfert de LB Ighb matures périphériques de souris CD40+/+ et plus encore de souris CD40-/- chez des souris invalidées pour le gène RAG2 (souris RAG2-/-), gène qui commande la recombinaison des éléments géniques des anticorps et des récepteurs pour l'antigène des LT et dont l'absence se traduit par la disparition des compartiments B et T, conduisait, chez ces LB, à une commutation isotypique amplifiée vers le gène IgG2ab. Pour les LB Ighb CD40-/- l'ordre de grandeur de la fréquence et du nombre absolu des cellules produisant l'IgG2ab est augmenté d'environ 500 fois lorsqu'ils sont transférés dans un environnement RAG2-/-.



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