Portail IP bandeau_genéral
  Impatvir


  Responsable : RIVIERE Yves (riviere@pasteur.fr)


  resume

 

Notre projet de recherche est essentiellement axé sur l'étude du rôle des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans la pathogénèse des infections virales de l'homme et en particulier de l'infection par virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) et par le virus de l'hépatite C (VHC). Plusieurs approches sont développées in vitro: cartographie des épitopes T et importance des réactivités croisées, présentation de particules virales exogènes aux CTL, contrôle de la réplication virale, et in vivo : reconstitution du système immunitaire dans des cohortes de patients infectés et traités par anti-rétroviraux, importance de l'induction de CTL dans l'efficacité des protocoles de vaccination dans des modèles animaux.



  rapport

cale

A . Cartographie des épitopes cytotoxiques, réactivités croisées entre sous-types viraux F.Buseyne, en collaboration avec C. Rouzioux, Hôpital Necker.

La diversité génétique du VIH-1 pose la question de son impact sur la reconnaissance de différents sous-types par les effecteurs CD8+. Cette question est particulièrement importante dans le domaine vaccinal. Les réactivités croisées des effecteurs cytotoxiques dirigées contre différents sous-types de VIH-1 ont été étudiée contre un épitope T bien défini et non plus au niveau de la protéine prise dans sa globalité. Des lignées reconnaissant l'épitope gag QASQEVKNW présenté par deux molécules HLA-B différentes ont été caractérisées chez cinq patients. Chaque patient reconnaît de 2 à 9 des 10 variants testés. Tous reconnaissent une combinaison de variants différents ce qui apporte la démonstration de la variabilité individuelle des reconnaissances croisées de variants viraux d'un même épitopeT cytotoxique (Buseyne et Coll , J. Virol., 2001).


B . Présentation de particules virales du VIH exogènes aux lymphocytes CD8+, F. Buseyne, T. Paquet, en collaboration avec O. Schwartz (Institut Pasteur) et J.P Abastado (IDM, Paris).

Les cellules dendritiques et les macrophages présentent les particules du VIH aux lymphocytes T CD8+ en absence de réplication virale. L'entrée de l'antigène est dépendante de l'interaction entre l'enveloppe du virus et son récepteur. Elle est plus efficace que l'ingestion des protéines par phagocytose ou macropinocytose et permettrait de cibler des antigènes vaccinaux (Buseyne et Coll., Nature Medicine 2001).


C . Inhibition de la réplication virale par les lymphocytes CD8+. M. Février.

En 1986, C.Walker et Coll., ont montré qu'une sous-population de lymphocytes, les lymphocytes T - CD8+ peut inhiber la réplication du VIH in vitro par l'intermédiaire de facteurs solubles. Différentes cytokines dont l'interleukine 16 et des C-C chimiokines (Rantes, MIP-1a, MIP-1b) et des C-X-C chimiokines (SDF-1) ont été impliquées. Avec les outils que constituent les clones de lymphocytes cytotoxiques, nous avons étudié les mécanismes de contrôle de la réplication virale (CRV) par les CD8+. Le but était d'évaluer l'importance de la spécificité (cytotoxique) des clones de LTC dans le CRV et d'identifier le rôle des chimiokines et cytokines dans le CRV. Les résultats obtenus avec un clone CD8+ spécifique du virus d'Epstein-Barr montrent que la capacité de contrôle des clones T CD8+ n'est pas liée à la spécificité de reconnaissance du VIH. D'autre part si les chimiokines sont impliquées dans le contrôle de la réplication au niveau de l'entrée, nous avons pu montrer qu'un deuxième niveau de contrôle, intervient après l'entrée du virus après l'initiation de la retrotranscription. Une conséquence importante de ce travail est qu'il semble bien que le nombre d'effecteurs susceptibles de contrôler la réplication virale par la sécrétion de CAF soit plus important que prévu initialement (Le Borgne et Coll., J. Virol., 2000).
On distingue plusieurs sous-types de lymphocytes sur la base de l'éventail des cytokines qu'ils produisent, soit type 1: interféron gamma (IFNg), soit type 2: interleukine 4 (IL4), soit type 0: IFNg+IL4. Nous avons poursuivi ce travail afin de déterminer si la fonction de contrôle de la réplication de VIH, sans cytolyse, était exercée spécifiquement par un des sous-types de cellules CD8+: Tc0, Tc1 ou Tc2. Des clones T CD4+ et CD8+ ont été établis à partir de cellules du sang périphérique de sujets séronégatifs et séropositifs pour VIH. La classification en type cellulaire a été faite sur la détection de la production des cytokines prototypes (IFN et IL4) par marquage intracytoplasmique. Des cellules T CD4+ [de type Th0, Th1 et Th2] ont été infectées avec un virus R5 (YU2b) ou un virus X4 (LAI) et mises en coculture avec les différents sous-types de cellules T CD8+. La réplication virale est suivie par la mesure de l'activité de la transcriptase inverse dans les surnageants de culture. Il ressort de cette étude que YU2b est beaucoup moins bien contrôlé que LAI quel que soit le type de cellules CD4+ infectées (si on regarde la fréquence des clones qui contrôlent); tous les sous-types de cellules T CD8+ sont capables de contrôler LAI quelque soit le type des cellules infectées (Th0, Th1 ou Th2).


D. Suivi des fonctions immunitaires chez l'enfant infecté par le VIH et traités par multithérapie antirétrovirale. F. Buseyne, B. Corre, F. Porrot, N. Bellal, E. Bui .en coll. Avec D.Scott-Algara (Institut Pasteur) et C.Rouzioux et S. Blanche, Hôpital Necker.

Depuis plusieurs années nos efforts sont focalisés sur l'étude d'une cohorte d'enfants infectés par voie materno-fœtale suivis par le Pr Stéphane Blanche. Une partie importante des enfants participent à des protocoles de thérapie anti-rétrovirale combinée avec ou sans anti-protéase. L'efficacité des traitements est évaluée par la mesure de la charge virale (plasmatique, virémie cellulaire et provirus intégré) en collaboration avec le laboratoire du Pr. Rouzioux à Necker. Pour l'évaluation de l'impact du traitement sur la reconstitution du système immunitaire, les différentes populations lymphocytaires CD4+ et CD8+ (marqueurs d'activation et naif/mémoire) sont étudiées en cytométrie de flux. L'activité fonctionnelle cytotoxique (LTC) est étudiée par la technique conventionnelle de relargage au chrome et par les techniques alternatives (Elispot et tetramères) nouvellement développées. Nous avons utilisé des tétramères de la molécule HLA-A2 complexés avec deux peptides immunodominants de la p17 et de la RT (collaboration Immunotech). La grande majorité des PBMC des enfants testés fixent le tétramère Gag (26/28) et le tétramère Pol (21/28). Les lymphocytes fixant les tétramères ont un phénotype de cellule "mémoire/activée" [CD27+/-, CD28-, CD45RA-, CD45RO+, HLADR+, CD69-]. Le suivi longitudinal d'un enfant montre une diminution du nombre des CD8+ Tetramères Gag+ parallèle à la diminution de la charge virale pendant les premiers mois de suivi. Cependant l'échec thérapeutique révélé par une remontée de la charge virale est aussi caractérisé par une remontée des cellules CD8+ Tétramères Gag + (Scott-Algara et Coll., J. Inf. Dis., 2001). Ce travail souligne l'intérêt de cette technologie pour la révélation des spécificités des lymphocytes CD8+, et nous poursuivons cette approche par la mesure de la capacité fonctionnelle de sécrétion de cytokines et chimiokines par les lymphocytes CD8+ s'attachant aux tétramères.
D'autre part, des tests Elispot effectués en parallèle avec les mêmes peptides correspondant à ces deux épitopes montrent une corrélation étroite entre les deux techniques. Nous avons vérifié que les lymphocytes T CD8+ sont seuls impliqués dans la sécrétion de gamma interféron dans la technique Elispot (Adeline Catteau, DEA 2000). Par ailleurs, la mise au point de technique Elispot utilisant des virus recombinant de la vaccine exprimant les protéines Gag, Pol et Env a permis de détecter des réponses positives chez la majorité des patients testés. Des résultats préliminaires d'une analyse en section croisée montre que les enfants qui négativent leur charge virale, ont moins de lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH que les non-répondeurs virologiques.


E. Modèles animaux: immunisation à base d'ADNs codant pour des domaines antigéniques des virus SIV et VIH-1 fusionnés à l'antigène de surface du virus de l'hépatite B . Etude d'immunogénicité et pouvoir protecteur chez le macaque. [collaboration avec A.L Puaux et M.L. Michel (INSERM U163, Institut Pasteur), R.Legrand (CEA, Fontenay) et Anne Marie Aubertin, (Strasbourg)]

Comme approche vaccinale pour lutter contre l'infection par le VIH-1 deux stratégies sont combinées : d'une part, pour favoriser la réponse humorale et cellulaire, un système de présentation d'épitopes utilisant comme molécule porteuse l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (AgHBs); d'autre part, pour stimuler la réponse cytotoxique, une vaccination à base d'ADN utilisant des vecteurs codant pour des domaines antigéniques de SIV et de VIH-1 fusionnés à cet antigène. Le macaque est le modèle animal utilisé dans cette étude puisqu'il présente l'avantage de pouvoir être éprouvé par infection avec un virus chimérique SHIV portant l'enveloppe de VIH-1. Des expériences réalisées chez la souris et le macaque ont montré que l'immunisation génétique au moyen de vecteurs ADN codant pour des antigènes chimériques VIH/HBs permet d'obtenir des réponses cytotoxiques fortes et durables (Le Borgne et Coll, Virology 1998, J. Med. Primat. 2000, Vaccine 2001).
De nouveaux vecteurs ADN codant pour des domaines antigéniques de l'enveloppe de VIH-1, de la capside et de la protéine nef de SIV ont été construits par Delphine Marsac et Mandal Singh.. Une épreuve virulente est prévue avec un virus SHIV portant l'enveloppe d'un isolat bitropique. Un suivi virologique et immunologique sera réalisé chez les animaux après épreuve. Ce projet est soutenu par l'ANRS par un contrat accordé au laboratoire de ML Michel et le notre pour la période 4/2000-3/2002. Une étudiante en thèse- Anne Laure Puaux- a rejoint le laboratoire pour travailler sur ce projet.


F- Étude de l'existence d'une réponse lymphocytaire CD8 chez des sujets co-infectés par VIH-1 et VHC. G. Janvier et F. Porrot (Coll avec H. Fontaine, S. Pol et H.Zylberberg, service d'Hépatologie, Hôpital Necker).

L'infection virale C est un problème de santé publique. Les thérapeutiques actuellement disponibles ne permettent d'envisager une éradication virale que chez environ 40 % des personnes traitées. Les tentatives de mise au point vaccinales sont pour l'instant en échec principalement du fait de la variabilité virale et d'une réponse immunitaire non protectrice chez la majorité des sujets chroniquement infectés. Environ dix pour cent des sujets infectés par le VIH-1 sont co-infectés par le VHC. Le but du travail initial était d'évaluer l'importance des activités CD8+ spécifiques du VIH-1 et du VHC chez des sujets co-infectés par ces deux virus. En utilisant des techniques de relargage au chrome et Elispot associées à l'utilisation de peptides synthétiques et de vecteurs vaccines exprimant les séquences peptiques virales nous avons montré que les réponses dirigées contre le VHC étaient beaucoup moins fréquemment détectées que celles dirigées contre le VIH-1. Les mécanismes permettant d'expliquer ces différences de fréquence de réactivité des lymphocytes CD8 sont étudiés. Les techniques pour la détection des activités spécifiques du virus de l'hépatite C (VHC) ont été validées chez des sujets co-infectés par le VIH-1 et le VHC (DESS d'immunotechnologie 2000, Geneviève Janvier).



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

JEWIARZ Danièle, I.P. djewiarz@pasteur.fr

BUSEYNE Florence, I.P. florence@pasteur.fr

FEVRIER Michèle, C.N.R.S. mfevrier@pasteur.fr

RIVIERE Yves, I.P. riviere@pasteur.fr

SINGH Mandal , visiteur USA, départ 10/2000

CATTEAU Adeline , stagiaire DEA, départ 09/2000

PAQUET Thierry, stagiaire DEA, arrivé 09/2000

PUAUX Anne Laure , thésarde, arrivée 09/2000

BUI Eida , médecin stagiaire , départ 09/2000

BELLAL Nassima, médecin stagiaire , arrivée 11/2000

FLEURY CORRE Béatrice, I.P. bgs@pasteur.fr

JANVIER Geneviève, I.P. gjanvier@pasteur.fr

PORROT Françoise, I.P. fporrot@pasteur.fr


filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr.