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  Responsable : Odile PUIJALON (omp@pasteur.fr )


  resume

 

La thématique centrale de l'Unité est l'analyse des facteurs qui déterminent l'issue d'une infection palustre, avec comme but de développer un vaccin visant à prévenir la pathologie consécutive à une infection par Plasmodium falciparum. Nos efforts de recherche visent à étudier les antigènes parasitaires et leur rôle afin de développer un vaccin en utilisant des molécules conservées reconnues par les effecteurs de la clairance parasitaire ; à comprendre les conséquences du polymorphisme parasitaire dans les relations hôte/parasite ; à identifier les facteurs parasitaires de pathogénicité ; à explorer les paramètres qui orientent le système immunitaire vers une réponse protectrice ou pathologique.



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L'objectif à long terme des recherches menées dans l'Unité est le développement de vaccins dirigés contre les stades érythrocytaires de Plasmodium. Quatre groupes de recherche sont centrés sur des programmes complémentaires, incluant le développement de vaccins, l'étude de terrain de la diversité parasitaire et l'analyse intégrée des interactions hôte/parasites qui conditionnent la physiopathologie du paludisme. Une des caractéristiques de l'Unité est de privilégier les études in vivo, aussi bien chez l'homme que chez le singe. Ceci implique le recours à des modèles expérimentaux d'infection ainsi qu'à des collaborations sur le terrain : études d'épidémiologie moléculaire, au Sénégal et en Guyane Française dans le cadre des Instituts Pasteur du Réseau International ; études de cas hospitaliers au Ghana ; étude de modèles expérimentaux chez le singe en Guyane et au Sri Lanka.

1. Le programme de développement vaccinal est centré sur des antigènes de stades erythrocytaires identifiés comme cibles de certains effecteurs de la réponse immune protectrice.
MSP-1 (S.Longacre, I. Holm, A. Manamperi). Le groupe de S. Longacre développe un programme de recherche explorant la région C-terminale conservée de l'antigène de surface du mérozoïte, MSP-1, exprimée sous forme de protéine recombinante dans le système Baculovirus. L'association hôte/parasite naturelle P.cynomolgi/singe toque constitue ici le modèle d'étude simien. Des essais vaccinaux effectués dans ce modèle ont montré que MSP-1p19 induisait bien un effet protecteur, à la fois puissant et de longue durée, contre des souches homologues ou hétérologues. L'état d'avancement des recherches sur MSP-1p19 est tel que des essais de vaccination de phase 1 sont envisagés. En parallèle, l'analyse de la réponse immune dirigée contre la partie conservée C-terminale et contre les domaines polymorphes de P.vivax MSP-1 a été effectuée. Enfin, la structure cristallographique de P.falciparum MSP-1 p19 a été déterminée en collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale. Elle confirme l'existence dans cette molécule des deux domaines EGF qui avaient été observés en cristallographie avec P.cynomogli MSP-1p19.
R23 : (O. Puijalon, P.Dubois, M.Huynh Quan Dat) : L'antigène R23 est la cible d'anticorps opsonisant les érythrocytes infectés par P.falciparum. Des expériences de vaccination conduite chez le singe-écureuil suggèrent qu'une protection peut être induite après immunisation avec une dose minimale de cet antigène. La réponse en anticorps contre R23 a été explorée chez des sujets exposés à P.falciparum dans des régions holo et mésoendémiques au Sénégal. La séroprévalence et la dynamique de la réponse anticorps sont semblables dans les deux régions. La saison des pluies est associée à une diminution de la prévalence des anticorps chez les enfants, suggérant un phénomène d'absorption des anticorps par les parasites circulants.
 


2. Etude sur le terrain de la diversité parasitaire et de ses conséquences sur la réponse immune (O.Puijalon, H. Jouin, D. Schleiermacher).

Le génotypage comparatif des parasites circulants et placentaires effectué chez des femmes sénégalaises a montré que dans 50 cas sur 58, les profils génotypiques n'étaient que partiellement superposables : il existe des allèles observés à la fois dans le sang périphérique et le placenta, mais aussi des allèles observés uniquement dans le sang ou dans le placenta. De tels biais de distribution des parasites chez un même hôte suggère l'existence d'une séquestration spécifique d'organe et met en question la valeur de la parasitémie périphérique comme élément de surveillance d'une infection par P.falciparum.
La réponse immune spécifique d'allèle contre une région hautement polymorphe de P.falciparum MSP-1 bloc 2 a été étudiée chez des habitants de deux villages sénégalais, Dielmo (à transmission pérenne) et N'Diop (transmission saisonnière), tirant partie de l'importante série de prélèvements longitudinaux ainsi que de la précision des données cliniques et parasitologiques. A Dielmo, le suivi longitudinal sur plusieurs années permet de montrer l'existence d'une réponse remarquablement fixée : on observe des profils de réactivité identiques, ne dépendant pas des génotypes parasitaires présents ou passés, avec une distribution des chaînes lourdes et légères qui reste constante au cours des années. Ces résultats suggèrent qu'il n'y a pas accumulation de nouvelles spécificités au cours de l'exposition à un nombre croissant d'allèles. Cette observation surprenante évoque un phénomène d'empreinte clonale, et contraste avec l'accumulation progressive des spécificités décrite pour les anticorps dirigés contre l'antigène variant PfEMP1. A ce stade, nos résultats suggèrent que cette capacité de figer ainsi la réponse pourrait constituer un nouveau mécanisme d'évasion du système immunitaire mis en œuvre par le parasite du paludisme.
Une analyse comparative de la diversité parasitaire a été effectuée dans différents groupes cliniques en Guyane Française, région hypoendémique où le paludisme survient en foci isolés. L'association d'un faible niveau de transmission et d'un système de soins bien organisé qui permet un traitement rapide, conduit à la réduction du nombre de porteurs sains de parasites. Tout ceci aboutit à un niveau remarquablement bas de polymorphisme parasitaire et à une proportion élevée d'infections simples à un seul génotype parasitaire. Cet environnement qui associe un pool limité de gènes parasitaires et une population d'individus non immuns fournit un environnement unique pour explorer les conséquences du polymorphisme parasitaire sur la gravité clinique. L'analyse des répertoires génotypiques de msp1, msp2 , glurp et var chez des patients atteints d'accès simples ou de paludisme grave, a montré que le paludisme grave était associé à l'infection par des parasites présentant une association génotypique particulière. Ainsi l'hypothèse, émise de longue date, que certaines souches présenteraient une virulence particulière, trouve ici sa première confirmation de terrain.
 


3. Facteurs parasitaires de pathogénicité (S. Bonnefoy, P.Pendyala, M.Diez Silva, M Guillotte, P. David, O. Puijalon).

Une approche de génétique réverse a été empruntée pour explorer les conséquences sur le cours de l'infection in vivo, de l'inactivation ou du remplacement allèlique de gènes codant pour des facteurs de pathogénicité. Une exploration systématique du transcriptome chez des parasites soumis à différentes conditions physiologiques a également été entreprise.
L'analyse comparative des génotypes de différentes souches parasitaires chez le singe Saimiri splénectomisé suggère que la pathogénicité d'une souche parasitaire est associée à une délétion de resa ainsi qu'à un allèle particulier de hrp1. Nous avons donc invalidé le gène resa dans la souche FUP/CB, souche de faible virulence chez le Saimiri. L'analyse des propriétés membranaires du globule rouge infecté est en cours, en particulier l'étude biophysique comparative de la rigidité membranaire et de la force d'adhésion à l'endothélium. L'analyse in vivo des conséquences de l'inactivation de resa sur la multiplication parasitaire et sur la pathologie est à l'étude chez le Saimiri.
Nous avons poursuivi le développement de nouveaux outils de génétique réverse, comprenant la mise au point de nouveau marqueurs de sélection ainsi que la construction de parasites exprimant la GFP.
En ce qui concerne le recours aux puces à ADN, notre premier objectif a été d'explorer le rôle de la rate dans la modulation du transcriptome parasitaire. En effet, on sait que la rate exerce un effet sur l'expression/exposition des antigènes parasitaires à la surface de l'érythrocyte infecté. Le criblage différentiel de puces à ADN constituées d'insertions amplifiées d'une banque d'ADN génomique de P.falciparum digéré par la Mung Bean nucléase, a permis de montrer que la présence de la rate chez le singe-donneur avait un effet sur le niveau de transcription de 185 gènes dont certains codent pour des polypeptides liés à la cytoadhérence et /ou à la variation antigénique. Il est particulièrement intéressant de noter que cette analyse a mis en lumière la modulation de l'expression de molécules accessoires appartenant aux " knobs ", actuellement explorés en tant que facteurs de virulence. 
 


4. Rôle de l'activation immune dans la physiopathologie du paludisme (C.Behr, S. Loizon, P.Boeuf, F. Remerand, J.C.Michel).

Les lymphocytes Tgd représentent une des sous-populations lymphocytaires principalement activée chez des enfants africains souffrant d'accès palustre. Ces lymphocytes sont présents avec une fréquence plus élevée chez les Africains en bonne santé (adultes et enfants) en comparaison des Caucasiens. La sous-population majoritaire de cellules T gd chez les Africains est la population T Vd1, population minoritaire chez les Caucasiens. Chez les enfants en accès aigu, cette sous-population TVd1 est activée transitoirement. L'analyse des chaînes Vg ne montre aucune association préférentielle de chaînes. L'analyse du répertoire Vd1 par immunoscope n'a pas mis en évidence d'expansion clonale préférentielle. Le marquage intracellulaire ex-vivo montre que les cellules TVd1 sont fortement productrices d'IFN-g. Chez ces enfants, les cellules T Vg9 sont également activées, leur étude est en cours. Le nombre total de cellules T gd circulantes et le rapport Vd1/Vg9 ne montrent pas de variation significative entre les formes cliniques. Les résultats obtenus jusqu'à ce jour sont compatibles avec le rôle supposé de la population Vd1 dans la régulation du système immunitaire et le retour à l'homéostasie.
L'analyse des profils de cytokines associés à différentes formes cliniques de paludisme a montré que, par rapport à l'anémie sévère ou à l'accès simple, le paludisme cérébral était associé à des niveaux significativement élevés d'IL-2R. L'anémie sévère est, elle, associée à des niveaux plus faibles de TNFR (I et II).
Le sepsis et le sepsis sévère présentent des analogies intéressantes avec l'accès simple et le paludisme grave, avec comme principal élément contribuant à la pathologie, l'existence d'une inflammation systémique. En collaboration avec l'Unité de soins intensifs de l'Hôpital Lariboisière à Paris, nous avons effectué un suivi longitudinal de malades souffrant de sepsis sévère ou d'inflammation locale intense. Nous avons mesuré le niveau d'expression d'HLA-DR à la surface des monocytes ainsi que celui des molécules co-stimulatrices CD80 et CD54 par cytométrie de flux quantitative ex-vivo ou après stimulation in vitro par le LPS. Ceci a montré que l'inactivation monocytaire est un phénomène général qui induit une régulation négative de l'HLA-DR, mais aussi d'autres molécules co-stimulatrices jouant un rôle important dans l'activation des cellules T.
Nous avons consacré d'importants efforts à l'établissement de conditions expérimentales ainsi qu'à la mise au point d'outils immunologiques et génétiques nécessaires aux études de la physiopathologie de l'infection par P. falciparum chez le singe-écureuil. Nous avons criblé des anticorps monoclonaux permettant l'identification fonctionnelle de sous-populations monocytaires. Ceci nous a permis d'établir différents paramètres biologiques de base et les profils d'activation normaux chez des animaux naïfs non infectés, ainsi que d'analyser la cinétique d'activation des différentes sous-populations cellulaires au cours de l'infection par P. falciparum.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LECUILLER Frédérique, Secrétaire I.P.

BEHR Charlotte, C.R.1 CNRS

BONNEFOY Serge, C.R. IP

DAVID Peter, D.R.2 CNRS

LONGACRE Shirley, D.R.2 CNRS

MICHEL Jean-Claude, Chef de Laboratoire, IPOM

PUIJALON Odile, Chef d’Unité

BŒUF Philippe, Etudiant (thèse)

DIEZ SILVA Monica, Etudiante (DEA)

MANAMPERI Aresha, Etudiante (thèse)

NORANATE Nitchakarn, Etudiante (thèse)

PENDYALA Prakash Rao, Chercheur Post-doctoral

REMERAND Francis, Etudiant thèse

GUILLOTTE Micheline, Technicienne I.P.

HUYNH QUAN DAT Myoura, Technicienne I.P.

HOLM Inge, Ingénieur I.P.

JOUIN Hélène, Ingénieur I.P.

LOIZON Séverine, Ingénieur CNRS


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