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  Responsable : GUESDON Jean-Luc (guesdon@pasteur.fr)


  resume

 

L'activité du Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps est orientée essentiellement sur l'analyse fonctionnelle et structurale des anticorps murins ou humains. Le Laboratoire s'intéresse plus particulièrement aux anticorps impliqués dans les maladies auto-immunes et aux anticorps capables de neutraliser des micro-organismes ou des toxines bactériennes ou eucaryotes.
Pour réaliser cette analyse nous utilisons et adaptons à notre objectif les techniques modernes de biologie cellulaire et de biologie moléculaire.
Ce volet est complété par une étude des antigènes, ligands ou inhibiteurs peptidiques présentés à la surface de phages (méthode du "phage display").
De plus, le Laboratoire établit des collaborations avec des Unités de l'Institut Pasteur ou d'autres organismes de Recherche dans le but d'appliquer la technologie des hybridomes à des projets de recherche fondamentale ou appliquée. Dans ce cadre, le Laboratoire a préparé et caractérisé des anticorps monoclonaux murins à spécificité fine.



  rapport

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La Calréticuline est un récepteur potentiel, impliqué dans la pénétration cellulaire des anticorps anti-ADN (Nabila Seddiki-Si Ahmed)

Une protéine de 50kDa a été purifiée comme un récepteur potentiel à partir des extraits membranaires de cellules, en utilisant des anticorps anti-ADN, F14-6 ou H9-3 biotinylés fixés sur une colonne d'immunoaffinité. Ces anticorps proviennent d'une fusion de souris lupique F1 (New Zealand Black x New Zealand White). Cette protéine a été identifiée comme étant la calréticuline par micro-séquençage. La microscopie confocale et les analyses en cytomètrie en flux montrent que la calréticuline est présente à la surface de nombreux types cellulaires. Elle est reconnue par différents anticorps anti-ADN en ELISA. La fixation de F14-6 sur les lymphocytes et les cellules CHO est inhibée par la calréticuline soluble. Ainsi, les anticorps anti-ADN utilisés dans cette étude se fixent sur la calréticuline, suggérant que celle-ci pourrait jouer un rôle dans leur pénétration intra-cellulaire et dans la pathogénèse du lupus.


Étude des anticorps catalytiques associés au lupus érythémateux systémique (Barbara Mouratou, Jean-Luc Guesdon)

L'objectif de ce travail est de définir le rôle physiologique des anticorps anti-ADN catalytiques présents dans les sérums des patients atteints de lupus érythémateux systémique (LES), maladie auto-immune, et capables de catalyser l'hydrolyse de la liaison phosphodiester des acides nucléiques.
La lignée de souris F1 NZB/NZW, connue pour présenter spontanément un LES, a été choisi comme modèle d'étude. Une méthode rapide de screening (catELISA) permettant de détecter avec efficacité la présence d'anticorps catalytiques dans un grand nombre d'échantillons, est actuellement au cours de développement.


Obtention d'anticorps humains par stimulation antigénique in vitro et librairie combinatoire (Farida Nato)

Pour produire des anticorps humains contre les antigènes non vaccinants, il est indispensable d'immuniser in vitro les lymphocytes avant leur immortalisation ou pour faire une librairie immunisée d'anticorps.
Les lymphocytes proviennent des amygdales, source intéressante de lymphocytes B car ils représentent 50 à 60% des cellules totales, ils sont présents à tous les stades de différenciation. Il est possible de générer une réponse primaire in vitro en utilisant les lymphocytes CD4+ sensibilisés in vivo par l'anatoxine tétanique du fait de la vaccination obligatoire contre le tetanos. L'immunogène utilisé est l'épitope T de l'anatoxine tétanique (ATT) couplé à l'épitope B de l'antigène d'intérêt. Cette approche permet d'obtenir la commutation isotypique in vitro car la réponse polyclonale est de type IgG (IgG2 ou IgG3). Il est possible de reproduire dans les grandes lignes la coopération cellulaire entre les différentes cellules immunocompétentes présentes dans le centre germinatif. La réponse ainsi obtenue reste cependant faible et peu de lymphocytes B spécifiques sont présents, ce qui peut expliquer l'absence d'hybridomes par immortalisation par fusion ou par transformation par le virus de Epstein Barr. Pour ces raisons, nous produisons les fragments d'anticorps par Génie Génétique et souhaitons construire des librairies immunes spécifiques pour l'antigène d'intérêt.

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B>Production de fragments d'anticorps dans les plantes (Farida Nato et Pierre Lafaye)

Ce travail est une collaboration avec le Dr Parastoo Ehsani (Institut Pasteur d'Iran) et le Dr Aimé Nato (Laboratoire de morphogénèse végétale expérimentale - Université Paris XI). La production de fragment d'anticorps dans les cellules de plantes peut fournir des réactifs bon marché pour l'immunodiagnostic et l'immunothérapie. Deux gènes murins codant pour des scFv dirigés contre l'IL4 et l'IL6 ont été clonés dans pGEJAE1 et introduit dans Agrobacterium tumefaciens. 251 disques folliaires de tabac ont été cocultivés avec Agrobacteria et la régénération des plantes a été réalisée sur milieu sélectif. Les résultats montrent que les plants de tabac transformés peuvent produire des scFv dirigés contre l'IL4 et l'IL6. Les racines sécrètent deux fois plus de scFv que les feuilles. Les caractéristiques biochimiques et immunochimiques des scFv purifiés à partir du tabac sont identiques à celles des scFv produits en bactérie.


Les peptides qui se fixent sur la région riche en Leucine de Listeria monocytogenes miment les anticorps monoclonaux anti-LRR (Iain Old et Pierre Lafaye)

Ce travail est mené en collaboration avec le Pr Pascale Cossart (Unité des interactions bactéries cellules). Des librairies de peptides exprimés à la surface du phage M13 ont été criblées vis à vis de l'internaline B (InlB) pour isoler des mimes peptidiques d'anticorps monoclonaux dirigés contre la région riche en Leucine (LRR) de Listeria monocytogenes. Sur 281 phage-peptides testés en ELISA,16 se fixent spécifiquement sur InlB et se répartissent en 5 groupes différents. Ces phages-peptides ont une affinité exceptionnellement élevée pour InlB avec un IC50 compris entre 560 pM et 1 nM. De plus, ils se fixent spécifiquement sur des fragments purifiés de InlB contenant la région LRR. Les phages et les peptides synthétiques dérivés entrent en compétition pour la fixation sur InlB avec des anticorps monoclonaux spécifiques de InlB qui bloquent l'invasion de cellules Vero mais pas avec des anticorps anti-LRR qui ne bloquent pas l'invasion. La modélisation moléculaire de l'anticorps anti-LRR A13-1 suggèrent qu'une tyrosine présente dans la région H2 de la chaîne lourde joue un rôle important dans l'interaction avec le LRR de InlB. La tyrosine présente dans toutes les séquences peptidiques pourrait mimer la tyrosine présente dans le paratope de l'anticorps. Par conséquent, le récepteur de l'InlB, non identifié, doit aussi posséder une ou plusieurs tyrosines impliquées dans l'interaction avec InlB.


Mise au point de réactifs immunologiques issus du génie génétique (Serge Pauillac)

La technique de préparation d'hybridomes murins par immunisation de souris suivie de la fusion des cellules immunocompétentes avec des cellules myélomateuses histocompatibles (Kholer et Milstein, 1975) permet la production illimitée de réactifs standardisés utilisables en clinique et en recherche fondamentale ou appliquée. La spécificité et l'affinité de ces réactifs peuvent être modulées par les techniques de biologie moléculaire impliquant plusieurs cycles de mutation et de sélection. Alternativement de tels réactifs peuvent être recherchés par la technique du "phage display" grâce au criblage de grandes banques de fragments d'anticorps (single chain Fv ou scFv) exprimés à la surface des phages filamenteux.
Ces deux voies seront explorées pour la production de protéines hybrides (scFv-PhoAv) composées d'un variant bactérien de phosphatase alcaline (PhoAv) couplé à divers fragments scFv spécifiques de la protéine E2 d'enveloppe du virus de l'hépatite C (collaboration avec Agata Budkowska, Laboratoire d'Epidémiologie Moléculaire des Entérovirus) ou de toxines marines (exemple : la saxitoxine, responsable de l'intoxication paralytique par les fruits de mer).


Développement de tests rapides pour le diagnostic de la peste et du choléra (Farida Nato)

Ce projet a obtenu un financement interne sous forme de Projet Transversal de Recherche (PTR) en collaboration avec Suzanne Chanteau (Unité Peste/Tuberculose de l'Institut Pasteur de Madagascar), J. M. Fournier (Unité du choléra et des vibrions) et E. Carniel (Unité de Bactériologie Moléculaire et Médicale).
L'objectif est de disposer d'un test immunochromatographique simple et rapide pour le diagnostic de la peste et du choléra qui sont 2 maladies bactériennes graves, à déclaration obligatoire et soumises au règlement sanitaire international. Elles sont dues respectivement à Y. pestis et V. cholerae. L'antigène F1, une glycoprotéique capsulaire spécifique de Y. pestis, excrété en abondance est parfaitement indiqué pour le diagnostic de la peste car il est présent en grande quantité dans le bubon, dans le sang et les urines des patients à de plus faibles concentrations. Dans le cas du choléra, le lipopolysaccharide est un bon candidat pour le diagnostic. Toutes les méthodes disponibles (PCR, ELISA, Dot-blot) sont difficiles à mettre en œuvre dans les pays en voie de développement. C'est pourquoi nous proposons de développer des tests rapides et simples à réaliser par des agents de santé. La bandelette devra être trempée dans un tube contenant l'échantillon à tester et la lecture se fera après 10 minutes. L'interprétation des résultats est aisée grâce à l'utilisation de particules d'or colorées. Les bandelettes peuvent être expédiées sous enveloppe et conservées quelques mois à température ambiante. La validation du test est réalisée à Madagascar.


Production d'anticorps monoclonaux murins (Farida Nato)

Dans le cadre de collaborations avec les chercheurs de l'Institut Pasteur, le laboratoire assure la préparation d'hybridomes murins en utilisant la technique développée par Köhler et Milstein (1975). Outre l'intérêt que les anticorps monoclonaux peuvent présenter dans certains secteur de diagnostic, ils sont aussi largement utilisés pour analyser la relation structure-fonction de divers modèles étudiés en recherche fondamentale. Les caractéristiques biochimiques (isotypes, mesure des afffinités, recherche des épitopes) des anticorps produits par les hybridomes sont déterminés dans le laboratoire par des techniques immunochimiques.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

ESNARD Muriel – I.P. (mesnard@pasteur.fr)

DEMANGEL Caroline, I.P., actuellement en stage post-doctoral.

GUESDON Jean-Luc, I.P. (guesdon@pasteur.fr).

LAFAYE Pierre, I.P. (plafaye@pasteur.fr)

MAZIE Jean-Claude, I.P. (jcmazie@pasteur.fr)

MOURATOU-PECORARI Barbara, I.P. (Boursière, Fondation Roux), (mouratou@pasteur.fr).

OLD Iain, I.P. (igold@pasteur.fr).

ELOUARD Béatrice, Technicienne, Centre d'Etudes du Bouchet (DGA).

FEKI Salma, Etudiante en thèse, Faculté des Sciences de Tunis.

MAHMOUDI Nassira, Etudiante en 3e cycle, Paris.

PAUILLAC Serge, Chargé de Recherche, Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés.

RALAFIARISOA Angeltine, Technicienne, I.P. de Madagascar.

TOUNSI Yacine, Ingénieur, I.P. d’Alger.

NATO Farida, I.P., Ingénieur.

SEDDIKI-SI AHMED Nabila, I.P., Ingénieur.

CADET Véronique, I.P., Technicienne.

DARTEVELLE Sylvie, I.P., Technicienne.

JEANNEQUIN Odile, I.P., Technicienne.

ROUYRE Sylvie, I.P., Technicienne.


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