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  Responsable : Pascale Cossart (pcossart@pasteur.fr)


  resume

 

Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, une bactérie responsable d'infections alimentaires graves qui est devenue un système modèle pour comprendre le parasitisme intracellulaire et l'exploitation des fonctions cellulaires par les pathogènes. L. monocytogenes est responsable de gastroentérites, dee septicémies, de méningites et d'avortements chez l'homme et certains animaux. La mortalité s'élève à 30 %. Les sujets à risque sont les femmes enceintes et les enfants à naître, les nouveaux-nés et les personnes agées, ainsi que les sujets immunodéprimés. L. monocytogenes a la capacité de traverser la barrière intestinale puis les barrière hémato-encéphalique et fœto-placentaire. In vitro, L. monocytogenes a la capcité d'entrer dans de nombreux types cellulaires et de s'y multiplier. Aprés lyse de la vacuole de phagocytose, les bactéries se répliquent, se déplacent dans le cytosol et passent de cellule en cellule en utilisant un mode de propulsion original : la polymérisation de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. En 2000, notre activité a porté sur les bases moléculaires de l'entrée dans les cellules in vitro et in vivo, l'analyse des vacuoles de phagocytose, l'étude des mouvements intra- et intercellulaires, la régulation de l'expression des gènes de virulence, l'identification de nouveaux gènes de virulence, et la détermination des séquences des génomes de L. monocytogenes et de L. innocua.



  rapport

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I. Entrée de L. monocytogenes dans les cellules de mammifères ( H. Bierne, R. Jonquières, N. Khelef, M. Lecuit, P. Mandin, S. Sousa)

L'étude des deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée dans les cellules, l'internaline (ou InlA) et InlB, a été poursuivie. L'internaline est impliquée dans l'entrée dans les cellules exprimant la E-cadhérine, principalement les cellules d'origine épithéliale. InlB permet l'entrée dans un grand nombre de types cellulaires.

L'internaline et son récepteur la E-cadhérine

Le récepteur de l'internaline a été identifié par chromatographie d'affinité. Il s'agit de la E-cadhérine. L'internaline interagit avec la E-cadhérine humaine, de poulet ou de cobaye mais pas avec la E-cadhérine murine ou celle de rat. L'unique acide aminé critique pour cette spécificité estl'acide aminé 16, qui est une proline dans les espèces permissives et un acide glutamique dans les espèces non permissives. Ces résultats expliquent pourquoi l'internaline ne joue aucun rôle dans le modèle d'infection murin. Nous avons analysé le rôle de l'internaline chez le cobaye ainsi que chez des souris transgéniques exprimant la E-cadherine humaine, générées en collaboration avec C. Babinet (Unité de Biologie du développement). A l'aide de ces deux modèles, nous avons démontré le rôle critique de l'internaline dans la traversée de la barrière intestinale par L. monocytogenes. Il s'agit du premier modèle transgénique d'une infection bactérienne humaine. Nous étudions actuellement le rôle de l''internaline dans la traversée des barrières hémato-encéphalique et fœto-placentaire. Nous avons également analysé le rôle du domaine intra cytoplasmqiue de la E-cadhérine dans l'entrée en générant des lignées de fibroblastes exprimant des E-cadhérines variantes, portant différentes délétions du domaine cytoplasmique. Nous avons démontré que la E-cadhérine doit être connectée au cytosquelette d'actine par les caténines pour permettre l'entrée. Nous étudions actuellement les évènements précoces permettant l'entrée, et tentons d'identifier toutes les protéines cellulaires impliquées dans la polymérisation d'actine et le remodelage de la membrane plasmique au site d'entrée. Nous nous interessons notamment au rôle de la vézatine, un ligand de la myosine VIIA recrutée aux jonctions adhérentes par l'alpha- caténine.

La protéine InlB et ses récepteurs gC1q-R et Met

InlB est associée d'une façon labile et originale à la surface de la bactérie. Cette association s'effectue par sa partie C-terminale, composée de motifs répétés de 80 acides aminés commençant par le dipeptide GW. Ce domaine interagit de façon non covalente avec les acides lipotéchoiques de la bactérie. L'un des récepteurs d'InlB est le gC1q-R. Il a été identifié par chromatographie d'affinité. gC1qR est le récepteur de la forme globulaire du C1q, le premier composant de la cascade du complément. Cette protéine n'a pas de domaine transmembranaire ni de domaine intracytoplasmique, ce qui implique l'existence d'un co-récepteur afin qu'un relai avec le reste de la cellule prenne place. Un possible corécepteur est Met, le récepteur de l'HGF ou " scattering factor ", qui appartient à la famille des récepteurs des facteurs de croissance à activité tyrosine kinase. Ce récepteur interagit avec la régions N-terminale d'InlB, la partie LRRs. Nous étudions actuellement les rôles respectifs de Met et de gC1p-R au cours de l''entrée et les évènements qui ont lieu après l'entrée ainsi que l'interaction éventuelle entre ces deux co-récepteurs. Nous avons aussi entrepris l'étude de la synergie entre l'internaline et InlB au cours de l'entrée. La contribution de la fraction de gC1q-R présente aux mitochondries est également aussi anlysée.
Nous avons montré récemment que les répétitions GW pouvaient aussi interagir directement avec les cellules, par le biais des glycosaminoglycanes. Le mécanisme de cette interaction et son rôle au cours du processus infectieux sont actuellement à l'étude.


La signalisation lors de l'entrée

Nous avons montré que la protéine InlB purifiée active la PI 3-kinase par l'intermédiaire de son récepteur Met en stimulant la phosphorylation de trois protéines adaptrices, Gab1, Cbl et Shc. InlB est le premier agoniste bactérien de la PI 3-kinase. Alors que les bactéries entrent dans les cellules sans produire d'importants réarrangements du cytosquelette d'actine, InlB soluble produit des replis membranaires et une polymérisation spectaculaire de l'actine. Nous analysons les mécanismes permettant ces réarrangements, et notamment les rôles du complexe Arp 2/3, du couple cofiline-LIM-kinase et ceux des GTPases de la famille Rho, qui sont impliquées dans la régulation de la polymérisation de l'actine. Nous recherchons aussi les cibles des produits de la PI 3-kinase. En aval de l'activation par InlB de l'activité PI-3 kinase, la PLC-gamma est stimulée, induisant la production d'IP3 et la libération des stocks de calcium intracellulaire. Cependant, la PLC-gamma n'a pas de rôle direct au cours de l'entrée mais pourrait intervenir au cours d'évènements plus tardifs. InlB est aussi capable d'activer NF-kB, ce qui pourrait conférer à lnlB des propriétés anti-apoptotiques. Cet effet potentiel d'InlB est actuellement étudié. Comme tous ces résultats l'illustrent, InlB est une protéine bactérienne ayant une activité de signalisation assez exceptionnelle.


II. Identification des molécules spécifiques des phagosomes contenant L. monocytogenes (J. Pizarro-Cerda)

Afin d'identifier les molécules clés pour l'internalisation de L. monocytogenes dans les cellules ainsi que pour la maturation de la vacuole d'internalisation, nous utilisons une approche de type protéomique et avons entrepris d'analyser la composition protéique et lipidique des vacuoles d'internalisation. Les vacuoles sont isolées par fractionnement subcellulaire aprés interaction des cellules avec soit L. monocytogenes, soit L. innocua exprimant l'internaline ou InlB soit des billes de latex recouvertes d'internaline ou d'InlB. La composition protéique de ces phagosomes est analysée après electrophorèse en gels bidimensionnels par des techniques combinant entre autres Western blotting et spectrométrie de masse. Le rôle de protéines candidates identifiées par cette approche est actuellement à l'étude.


III. Les mouvements intracellulaires et intercellulaires actine-dépendants (E. Gouin, V. Villiers)

Motilité de L. monocytogenes

Nous poursuivons l'étude de la protéine de surface ActA. Par une approche génétique couplée à une approche biochimique menée en collaboration avec MF Carlier (CNRS, GIF sur Yvette), nous étudions l'interaction d'ActA avec le complexe Arp2/3, qui est le nucléateur initiant la polymérisation de l'actine.

Motilité de Rickettsia conorii

R. conorii est une bactérie intracellulaire stricte qui possède une motilité dépendante de la polymérisation de l'actine, comme L. monocytogenes, S. flexneri ou le virus de la vaccine. Son mécanisme de polymérisation d'actine semble cependant original, puisque les filaments d'actine polymérisée sont longs, non branchés et fixés sur la bactérie et ne contiennent pas le complexe Arp2/3. Le séquençage du génome de R.conorii au Génoscope d'Evry est achevée.
Les données actuelles font apparaître un gène candidat impliqué dans la motiliité actine dépendante dont nous essayons d'analyser la fonction.


IV. Régulation de l'expression des gènes de virulence (J. Johansson, A. Renzoni)

La protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L. monocytogenes. La régulation de l''expression de cette protéine est complexe. Dans certaines conditions environnementales où les gènes de virulence sont réprimés, la protéine peut être présente mais inactive. L'expression de la protéine est augmentée en présence des cellules hôtes ou d'extraits cellulaires. Nous recherchons le(s) signal(aux) cellulaires responsables de cette induction. Nous nous interessons également aux mécanimes moléculaires de la régulation de PrfA par la température ainsi qu'aux modifications post-traductionnelles (fixation d'un cofacteur…) de PrfA pouvant affecter sa fonction. Nous étudions aussi d'autres protéines qui pourraient avoir une activité de régulateur transcriptionnel.


V. Identification de nouveaux gènes de virulence par mutagénèse aléatoire (F. Bourdichon, H. Fsihi)

Pour identifer de nouveaux gènes de L. monocytogenes indispensables au processus infectieux de L. monocytogenes in vivo dans le modèle exprérimental murin, nous avons utilisé une approche génétique appelée mutagénèse STM ou "Signature-tagged mutagenesis'. Nous avons construit une banque de mutants de L. monocytogenes étiquetés à l'aide de 96 transposons différents. Ces mutants ont été utilisés pour infecter des souris; et les mutants présents dans l'inoculum initial et absents dans les tissus aprés plusieurs jours d'infection, incapables de survivre chez la souris ont été analysés. Les gènes mutés ont été identifiés. Leur fonction respective est actuellement en cours d'analyse.


VI. Séquençage des génomes de L. monocytogenes et L. innocua, analyse post génomique et mutagénèse ciblée (D. Cabanes, O. Dussurget, P. Dehoux, E. Milohanic)

En collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Pathogènes (P. Glaser, C. Buchrieser et L. Frangeul) et un consortium européen, nous avons annoté et comparé les génomes de L. monocytogenes et L. innocua, une espèce non pathogène du genre Listeria. Une analyse transcriptionnelle dans différentes conditions de croissance est menée pour caractériser les gènes dont l'expression est régulée dans les conditions environnementales rencontrées par L. monocytogenes Nous analysons aussi par cette approche transcriptomique, les gènes régulés par PrfA et qui sont sans doute de nouveaux gènes de virulence. Une étude de la variabilité de ces résultats dans différents isolats est aussi entreprise.
D'autre part, nous inactivons des gènes présents chez L. monocytogenes et absents chez L. innocua, en particulier des gènes codant ainsi que différentes protéines de surface afin d'identifer de nouveaux gènes de virulence.


Légendes des photos :
Photo 1: Entrée de L. monocytogenes dans les cellules Caco-2 (microscopie électronique à balayage) [L. monocytogenes in Caco-2 cells (Scanning electron microscopy]

Photo 2:Comète d'actine de Rickettsia conorii [Rickettsia conorii actin tails]



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Isabelle Carton

BIERNE Hélène, CR1 INRA

DRAMSI Shaynoor, CR1 IP

DUSSURGET Olivier, CR1 IP

KHELEF Nadia, CR1 IP

BOURDICHON François, Etudiant en thèse, boursier MENSRT

CABANES Didier, Stagiaire post-doctorant CEE

JOHANSON Jorgen, Stagiaire post-doctorant Bourse du gouvernement suédois

JONQUIERES Renaud, Etudiant en Thèse

LECUIT Marc, Etudiant en Thèse

MILOHANIC Eliane, stagière post-doctorant CEE

MANDIN Pierre, Etudiant en Maitrise, stagiaire

PIZARRO-CERDA Javier, Stagiaire Post-Doctorant ARC

SOUSA Sandra, Etudiante en thèse, Bousière du gouvernement portugais

DEHOUX Pierre, Ingénieur IP

GOUIN Edith, Ingénieur IP

VILLIERS Véronique, technicienne IP


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