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  Responsable : BUCKINGHAM Margaret (margab@pasteur.fr)


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Nos recherches sont centrées sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellule progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette et du cœur pendant le développement. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et la contribution de cellules souches à la régénération. Le modèle expérimental est la souris, avec manipulation de gènes de régulation.



  rapport

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La formation du muscle de squelette [Ted Chang, Philippe Daubas, Juliette Hadchouel, Jacqueline Perreau, Didier Rocancourt, Ralf Spörle, Shahragim Tajbakhsh — collaborations avec les laboratoires de G. Cossu, P. Maire, T. Partridge, M. Polimeni, P. Rigby]

En 1997 nous avions démontré que Myf5 et Pax3 se situent en amont de MyoD dans la hiérarchie génétique qui régule la myogenèse. Actuellement nos recherches se focalisent sur la régulation, la fonction et la manipulation, avec introduction d'autres séquences, de ces deux gènes.

Nous analysons la régulation du gène Myf5 par une approche de transgenèse chez la souris, avec utilisation des YACs comportant les grands fragments d'ADN autour du gène. Ainsi plusieurs régions allant jusqu'à 96 kbp en amont de Myf5 ont été identifiées comme étant nécessaires pour différents aspects de l'expression spatiotemporelle du gène. Plusieurs enhanceurs ont été mis en évidence qui renferment les séquences qui ciblent spécifiquement différents sites de myogenèse. L'étude fine de l'expression de Myf5 et d'autres gènes marqueurs a amené à l'identification de domaines particuliers du somite présentant des comparaisons importantes avec d'autres espèces de vertébrés. Un autre aspect inattendu d'expression de Myf5 est sa transcription dans les domaines particuliers du système nerveux central où la protéine n'est pas détectée et il n'y a pas de phénotype apparent chez le mutant. Néanmoins une séquence régulatrice de Myf5 cible spécifiquement ces sites.

La première mutation ciblée du gène Myf5, avec l'introduction du gène rapporteur nlacZ, nous a permis d'analyser les effets sur la myogenèse chez l'embryon mais pas plus tardivement, à cause d'un défaut dans la formation des côtes qui interfère avec la respiration. Ce défaut est probablement dû à un effet en cis d'un autre gène dans le locus de Myf5. Avec un allèle muté d'une configuration différente nous avons obtenu des homozygotes viables. L'analyse des fibres musculaires adultes révèle un rôle pour Myf5, dans la prolifération des cellules satellites qui sont associées aux fibres et essentielle pour la régénération. Le fait que Myf5 marque ces cellules a permis, en conjonction avec d'autres marqueurs, de mettre en évidence une sous-population, éventuellement de type cellules souches.

Vu la complexité du locus Myf5 avec la présence du gène MRF4 qui code un autre facteur myogénique, et d'autres gènes éventuels, nous sommes en train de construire des mutations ciblées précises dans les gènes Myf5 et MRF4 pour éviter tout effet secondaire. Nous avons aussi introduit le gène rapporteur GFP dans un allèle de Myf5 qui nous permet de suivre les mouvements de cellules précurseurs du muscle in vivo. D'autres manipulations génétiques incluent l'introduction de la séquence codante pour MyoD à la place de Myf5 dans le but de comparer la fonction de ces deux facteurs de détermination myogénique, indépendemment des différences dans leur expression, chez l'embryon et chez l'adulte.

Le gène Pax3 est également régulé par les séquences complexes qui ciblent l'expression dans les précurseurs musculaires et dans d'autres types cellulaires chez l'embryon. L'introduction des gènes rapporteurs nlacZ et alkaline phosphatase dans Pax3, nous a permis de suivre les cellules qui l'expriment chez les souris normales et mutantes. Nous constatons une expression inattendue dans les cellules du muscle adulte, ouvrant la possibilité que Pax3 comme son orthologue Pax7, joue un rôle clé dans la myogenèse chez l'adulte aussi bien que chez l'embryon.

Dans la cascade de régulation qui va de Pax3 à MyoD et l'activation de la myogenèse, plusieurs autres facteurs de transcription et co-facteurs ont émergé récemment comme intervenants potentiels, tels les membres de la famille d'homéoprotéines Six. Nous avons ciblé un allèle de Pax3 avec une séquence encodant une forme dominante négative de Six (Six4) dans le but de mieux définir le rôle de ces facteurs en amont de la formation du muscle.

Les voies de signalisation qui contrôlent l'initiation de la myogenèse ont fait l'objet de nos recherches. Les séquences régulatrices du gène Myf5 sont étudiées dans ce contexte. Pour mieux comprendre l'éventuel rôle de la voie de signalisation Notch dans la spécification de cellules musculaires nous avons ciblé un allèle des gènes Pax3 et Myf5 avec une séquence codante pour une forme intracellulaire de Notch, constitutivement activée. Les perturbations, particulièrement évidentes dans le cas de l'allèle Pax3, dans les cellules musculaires et les dérivés de la crête neurale, sont à l'étude.


Cardiogenèse [Robert Kelly, Marguerite Lemonnier, Sigolène Meilhac, Andrew Munk — collaborations avec les laboratoires de N. Brown et J.-F. Nicolas]

L'expression régionalisée de certains transgènes exprimés dans le muscle cardiaque aussi bien que dans le muscle du squelette, nous a fourni un outil très intéressant pour suivre différents sous-domaines du myocarde. Ainsi dans les explants du tube cardiaque précoce nous avons pu définir une fenêtre du temps pendant laquelle l'identité des oreillettes gauche/droite reste flexible tandis que le ventricule l'a déjà acquise. Le développement des vecteurs adénoviraux qui expriment différentes molécules de signalisation et facteurs, nous permet de manipuler l'acquisition de cette identité sur l'axe gauche/droite ainsi éventuellement que celle du ventricule sur l'axe antérieur/postérieur.

Dans la plupart des cas les séquences régulatrices des transgènes sont responsables pour la régionalisation de leur transcription dans le cœur. Nous tentons de définir ces séquences. A la suite de manipulations de cultures de cardiocytes préparées à partir de différentes régions du cœur, nous constatons que le patron d'expression du transgène devient figé assez tôt pendant le développement, probablement via la conformation chromatinienne et/ou modification d'ADN.

Une lignée transgénique, dont l'expression du transgène est par contre due au site d'intégration, a été très informative sur la contribution inattendue de cellules provenant du mésoderme antérieur au myocarde de la voie efférente du cœur. Ce phénomène est confirmé par le suivi de ces cellules, marquées par injection de DiI, dans les embryons en culture. Le site d'insertion du transgène est dans la proximité du gène Fgf10, dont l'expression suggère une implication dans ce processus. L'identification de l'enhanceur éventuel ciblé par le transgène et l'analyse de la formation de cette partie du cœur en l'absence de signalisation par Fgf sont en cours.

La question de l'origine des populations de cellules qui colonisent les différentes parties du cœur peut également être abordée par une analyse clonale rétrospective. Dans ce but nous avons ciblé le gène d'actine cardiaque avec un gène rapporteur nlaacZ, dont un événement de recombinaison rare rend le gène fonctionnel, nlacZ, avec marquage d'une cellule qui exprime l'allèle de l'actine cardiaque par la b-galactosidase. L'analyse des clones cardiaques ainsi visualisée chez l'embryon démontre déjà que le pool de cellules fondatrices est grand. La comparaison avec le muscle de squelette, également analysé avec ce transgène, montre des différences intéressantes.



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Myriam TAISNE (Institut Pasteur)

Philippe DAUBAS (CNRS)

Robert KELLY (INSERM)

Marguerite LEMONNIER (INSERM)

Frédéric RELAIX (INSERM)

Shahragim TAJBAKHSH (Institut Pasteur)

Ted CHANG (postdoc)

Juliette HADCHOUEL (étudiante en thèse

Ralf SPÖRLE (postdoc)

Sigolène MEILHAC (étudiante en thèse)

Andrew MUNK (postdoc)

Catherine BODIN (IP)

Dominique MICHEL (IP)

Jacqueline PERREAU (CNRS)

Didier ROCANCOURT (IP)


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