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  Responsable : Alain Jacquier (jacquier@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae (maturation, transport, dégradation).
Pour cela, nous exploitons une banque d'interactions double hybride développée les années précédentes dans le laboratoire.
Nous validons et étendons le réseau d'interactions par des approches biochimiques (purification de complexes) et génétiques (cribles de co-létalité par exemple) afin d'identifier la fonction de nouvelles protéines.



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L'unité de Génétique des Interactions Macromoléculaires étudie divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure S. cerevisiae. Nous exploitons une banque d'interactions double hybride du laboratoire pour identifier la fonction de nouveaux facteurs impliqués dans ces processus. Nous sélectionnons, dans cette banque d'interactions, des candidats de fonction inconnue connectés de manière multiple et néanmoins spécifique à une voie métabolique donnée. Dans un premier temps, différentes approches génériques sont appliquées à ces candidats. Dans un deuxième temps, des tests fonctionnels plus spécifiques sont utilisés pour affiner la caractérisation de ces nouvelles protéines.


Approches génériques

Exemple de réseau fonctionnel issu de la base de données double hybride : implication des protéines Lsm dans la dégradation des ARN messagers

Le réseau d'interaction double-hybride construit autour des huit protéines Lsm révèle qu'elles sont étroitement liées entre elles suggérant l'existence d'un complexe Lsm. Des données de la littérature laissaient supposer que les deux protéines Lsm connues à ce moment-là pouvaient être liées à l'épissage. Nos résultats ont montré qu'effectivement les protéines Lsm étaient connectées à des facteurs d'épissage spécifiques d'une étape donnée de la formation du spliceosome. De façon surprenante mais non ambiguë, nous observons que les Lsm sont également connectées à la voie de dégradation cytoplasmique des ARNm par l'intermédiaire des protéines Dcp1, Dcp2, Xrn1 et Mrt1 (Fromont-Racine et al. (2000) Yeast, 17, 95-110). Cette étude suggérait que des complexes Lsm pouvaient être impliqués dans deux voies métaboliques différentes : l'une nucléaire, l'autre cytoplasmique. Cette hypothèse a maintenant été démontrée dans des études indépendantes.

Purification de complexes biochimiques

Afin de valider biochimiquement l'appartenance des candidats sélectionnés à un réseau d'interactions physiques donné, nous utilisons une technique de purification biochimique des complexes par double affinité. Les protéines de ces complexes sont identifiées par spectrométrie de masse en collaboration avec le "Plateau Technique Protéomique" de l'Institut Pasteur (A. Namane).
Nous avons ainsi déjà analysé six complexes biochimiques, à partir desquels plus de 40 protéines ont été identifiées. L'analyse fonctionnelle de ces différents complexes est en cours. Par exemple, nous avons pu caractériser 12 nouvelles protéines de la petite sous unité ribosomale mitochondriale (voir plus loin). De même, nous caractérisons actuellement de nouveaux complexes impliqués dans la maturation des ARN ribosomaux 5,8S et 25S (voir plus loin).

Cribles génétiques de co-létalité

Les cribles de co-létalité fournissent des informations de nature fonctionnelle et donc très complémentaires des informations de nature physique fournies par la méthodologie du double hybride. Le principe général de cette approche est de rechercher des mutations qui vont induire un phénotype de croissance uniquement dans une souche mutée pour un autre gène. La mise en évidence d'un phénotype ne s'exprimant que quand les deux mutations sont présentes simultanément permet de révéler les redondances fonctionnelles très nombreuses qui masquent souvent la fonction des gènes étudiés. Afin de simplifier et de standardiser plusieurs étapes clés de la méthodologie, nous apportons un certain nombre de modifications à la technique. Des protéines de fonction inconnue physiquement reliées à la voie d'épissage ou à une voie de dégradation des ARN sont en cours d'analyse.


Analyses fonctionnelles spécifiques

Pour un certain nombre de sous-réseaux sélectionnés dans la base de données double hybride, l'analyse fonctionnelle se fait dans le cadre de collaborations spécifiques. Nous ne développons ci-dessous que les analyses fonctionnelles directement poursuivies dans le laboratoire.

Composants de la petite sous-unité ribosomale mithochondriale

La protéine Ykl155c est reliée en double hybride à de nombreuses protéines, ce qui pourrait faire supposer que ces interactions sont non spécifiques. Toutefois, sa connexion à la fois à des facteurs d'épissage et à des facteurs de transport faisait d'elle un candidat attrayant. En fait, le complexe associé à Ykl155c s'est révélé correspondre à la petite sous-unité ribosomale mitochondriale. Ceci nous a conduit à identifier 12 nouvelles protéines de cette sous-unité ribosomale (Saveanu et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 15861-15867). Nous avons vérifié que ces nouveaux facteurs étaient effectivement localisés dans la mitochondrie et qu'ils étaient nécessaires à la fonction de celle-ci. Ce travail montre les limites du double hybride. Nous avons en effet sélectionné ici des interactions artéfactuelles. Ce sujet, bien que mené avec succès, n'est pas poursuivi car il est trop éloigné de la thématique générale du laboratoire.

Rôle d'une protéine intranucléaire du nucléopore

La protéine Yar002w a été choisie car elle est connectée de manière multiple à des protéines impliquées dans le transport, laissant supposer son implication dans le transport nucléo-cytoplasmique. Une partie des liens double hybride a été confirmée par l'approche biochimique en identifiant les facteurs associés de manière stable à cette protéine. Cette protéine a depuis été identifiée comme la nucléoporine Nup60 (Rout et al. J Cell Biol, 148, 635-651). Des liens double hybride, ainsi que des liens génétiques que nous avons identifiés, suggèrent un rôle de cette protéine dans l'export des ARN. Cependant, l'ensemble des résultats indique que cette protéine a une fonction plus pléïotropique, à un carrefour des voies de transport, en interagissant avec des protéines du nucléoplasme. Ce travail fait l'objet d'une collaboration avec le groupe de Ulf Nehrbass à l'Institut Pasteur.

Caractérisation d'un complexe nucléaire pré-ribosomique

La protéine Ynr053c, que nous avons appellée Nog2 (Nucleolar-G-Protein 2), est nucléaire/nucléolaire. Elle est l'homologue chez la levure de la protéine humaine Ngp-1. La purification biochimique par affinité du complexe qui lui est associé a révélé qu'elle est associée à une sous-unité pré-60S nucléaire. Ce complexe est par ailleurs constitué, en plus d'un sous-ensemble de protéines ribosomales, de deux nouveaux facteurs, Nog1 et Rlp24. Nous avons montré que Nog2 est essentielle pour les dernières étapes de la biogénèse de la grande sous-unité ribosomique 60S. Nog2 et Nog1 possèdent un domaine potentiel de fixation du GTP et pourraient être impliquées dans la coordination des étapes de maturation et d'export de la grand sous-unité ribosomale.



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Odile LABOUISE

Micheline FROMONT-RACINE , CNRS CR1

Pierre LEGRAIN, CNRS DR2

David BIENVENU, DEA

Gwenaël BREARD, 2ème année de thèse

Caroline CLERTE, dernière année de thèse

Cosmin SAVEANU, thèse de doctorat en juin 2001

Laurence DECOURTY, technicienne supérieure de laboratoire

Florence RICARD, bioinformaticien


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