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  Genmol


  Responsable : Pugsley, Anthony P. (max@pasteur.fr)


  resume

 

Dans l'unité de Génétique Moléculaire, nous étudions les aspects fondamentaux de l'activation de transcription et l'exportation/sécrétion de protéines chez les bactéries. Les systèmes modèles étudiés sont le régulon maltose d'E. coli, dans lequel la transcription des gènes impliqués dans le transport et le métabolisme de maltodextrines est dépendant de la protéine MalT, le système de sécrétion de type II par lequel des protéines sont transportées à travers la membrane externe, et la localisation de lipoprotéines dans l'enveloppe d'E. coli.



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L'activation de transcription et le ciblage de protéines vers différents compartiments de la cellule ou vers l'extérieur sont des processus fondamentaux complexes qu'il convient d'analyser dans un organisme modèle simple tel que la bactérie Escherichia coli.

Des études génétiques, ayant pour but de déterminer les gènes impliqués dans le transport et le métabolisme de maltodextrines, furent initiées dans le groupe il y a 20 ans. L'expression de ces gènes requiert l'activateur de transcription MalT, une protéine de 103 kDa qui se fixe à des sites spécifiques dans leurs promoteurs. Sa capacité d'activer la transcription à ces promoteurs est contrôlée par un effecteur spécifique, le maltotriose, et par l'ATP, ainsi que par trois effecteurs négatifs, les protéines MalK (composant de la perméase du système) MalY et Aes. De plus, le mécanisme d'activation de transcription par MalT seule ou en synergie avec CRP (catabolite response protein) dépend du promoteur et de la configuration des sites de fixation de MalT et de CRP qui le composent. Des études biochimiques et structurales commencent à révéler des détails de ce qui semble être l'un des plus complexes systèmes de contrôle génétique connus chez les bactéries. Les effecteurs négatifs stabilisent une forme monomérique et inactive de MalT tandis que le maltotriose induit la formation de multimères capables d'activer la transcription. MalT est composée de 4 domaines. Le domaine C-terminal se fixe aux sites spécifiques dans les promoteurs, tandis que les trois autres domaines, qui interagissent avec deux des effecteurs et au moins l'un des effecteurs négatifs, pourrait être considéré comme un nouveau module d'intégration des signaux. Ces domaines ont été caractérisés par des approches génétiques et biochimiques et leurs structures sont en cours d'analyse par cristallographie aux rayons X. Dans une approche complémentaire, la forme oligomérique de MalT et ses interactions avec son ADN code sont en cours d'analyse par cryomicroscopie électronique. (Evelyne Richet, Olivier Danot)

La voie de sécrétion de type II (le sécréton) est empruntée par des protéines extracellulaires chez de nombreuses bactéries à Gram-négatif. Notre caractérisation initiale du sécréton de la pullulanase, enzyme amylolytique de Klebsiella oxytoca, révéla un système composé de 11 protéines essentielles au transport de l'enzyme à travers la membrane externe et qui s'ajoutaient au système Sec par lequel la pullulanase transite la membrane cytoplasmique. Les produits de ces 11 gènes furent identifiés et localisés dans la cellule et une analyse biochimique de certaines d'entre elles a été entamée. Un deuxième sécréton, cette fois-ci d'E. coli, a été identifié et caractérisé plus récemment. Ce système, habituellement cryptique, transporte une chitinase.

Il y a plusieurs années déjà, nous avons noté la similitude entre les composants du sécréton et ceux de la machinerie d'assemblage de pili de type IV. Ces pili, des appendages de surface, sont composés de sous-unités (appelées pilines) que l'on peut considérer comme protéines sécrétées. La séquence des 30 premiers acides aminés de 5 composants du sécréton (les protéines G,H,I,J et K) est très similaire à celle de la région correspondante des pilines, ce qui nous a amené à proposer que les protéines G à K pouvaient être elles aussi assemblées dans une structure de type pilus. En effet, lorsque les bactéries sont cultivées sur un milieu solide et le gène codant la protéine G légèrement surexprimé, on détecte des pili entièrement composés de la protéine G. Ainsi, la pullulanase et la protéine G sont sécrétées, et leur sécrétion nécessite les mêmes composants du sécréton. Nous essayons de déterminer la structure de la protéine G ainsi que la fibre qu'elle forme pour pouvoir identifier les éléments nécessaires à sa sécrétion et à son assemblage. D'autre part, nous étudions d'autres composants du sécréton, notamment la protéine D (la sécrétine) qui semble former une structure oligomérique qui permettrait le passage de la pullulanase et/ou du pilus à travers la membrane externe. Nous étudions également deux protéines, C et E, que l'on pense être impliquées, respectivement, dans le couplage d'énergie au processus de sécrétion de la pullulanase et l'assemblage de pili. A plus long terme, nous voulons caractériser leurs interactions avec les autres composants du sécréton et la pullulanase ainsi qu'isoler le sécréton complet pour analyse structurale et pour reconstitution in vitro. (Odile Mary-Possot, Olivera Francetic, Anthony Pugsley)

Contrairement à la plupart des protéines sécrétées par le sécréton, la pullulanase est une lipoprotéine qui demeure ancrée, par les lipides N-terminaux, dans la membrane externe lorsqu'elle est sécrétée. Cette observation nous a incité à étudier les mécanismes de ciblage de lipoprotéines, dont E. coli peut synthétiser = 100 espèces, vers différents endroits de l'enveloppe. La majorité des lipoprotéines est destinée à la membrane externe, tandis que 5 à 6 restent ancrées dans la membrane interne, toutes face au périplasme. Nous avons montré que le signal qui distingue entre ces deux sites est l'acide aminé en position +2, en aval de la cystéine acylée N-terminal ("la règle +2"). Une lipoprotéine avec un aspartate, un acide aminé aromatique ou une proline en position +2 sera localisée dans la membrane interne tandis que toute autre lipoprotéine sera transportée à la membrane externe. Le système de transport vers la membrane externe (Lol) a été extensivement caractérisé par Tokuda et coll. Pour étudier les facteurs éventuellement impliqués dans la rétention de lipoprotéines dans la membrane interne, nous utilisons la lipoprotéine Llp codée par le bactériophage T5 et qui neutralise son récepteur dans la membrane externe. Cette protéine est à la base d'une sélection génétique qui nous permettra d'isoler des mutants affectés dans la rétention de lipoprotéines dans la membrane interne ainsi que de créer une lipoprotéine dont le transport vers la membrane externe ne semble pas obéir à la règle +2. (Anthony Pugsley)



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Armelle Lavenir

Evelyne Richet, CNRS, DRII

Odile Mary-Possot, Chargé de recherche IP

Olivier Danot, Assistant de Recherche IP

Olivera Francetic, Chargé de recherche IP

Nicolas Bayan, Maître de Conférences Université Paris XI

Guillaume Vignon, stagiaire thèse

Robichon Carine, stagiaire thèse

Rolf Koehler, postdoc

Nicolas Joly, stagiaire DEA

Dominique Vidal-Ingigliardi, Ingénieur

Ingrid Guilvout, Technicienne supérieure de laboratoire

Nathalie Nadeau, Technicienne de laboratoire

Maria Reyngoud, Agent de laboratoire


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