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  Responsable : GICQUEL Brigitte (bgicquel@pasteur.fr)


  resume

 

Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique: elle est responsable d'environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de M. tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie suceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. L'unité étudie également la possibilité d'utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d'autres maladies, telles que le SIDA.



  rapport

cale

Etude génétique des déterminants de virulence (Brigitte Gicquel et Christophe Guilhot)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide pAL5000 de Mycobacterium fortuitum et contenant le marqueur de contre-sélection sacB (vecteur ts/sacB), a permis de sélectionner des évènements génétiques rares chez les mycobactéries, en particulier chez les espèces appartenant au complexe de M. tuberculosis. Ce vecteur a permis de rechercher des échanges alléliques conduisant à l'inactivation d'un certain nombre de gènes choisis pour leur similarité avec des gènes caractérisés chez d'autres pathogènes et connus pour jouer un rôle dans la virulence ou le maintien intracellulaire. Récemment, en collaboration avec l'équipe de Carlos Martin (Faculté de Médecine de Saragosse, Espagne), nous avons ainsi isolé un mutant possédant le gène codant pour le régulateur putatif phoP inactivé par insertion. Ce gène proche du gène putatif phoR, est essentiel à la multiplication de M. tuberculosis dans des macrophages de souris en culture in vitro et chez la souris principalement au niveau du poumon et de façon moindre au niveau de la rate et du foie. Ce couple de gène phoP/phoR possède des similarités avec le système à deux composants phoP/phoQ, un régulateur de plusieurs déterminants de la virulence de Salmonella. Chez la souche M. bovis multirésistante aux antibiotiques et responsable d'une épidémie en Espagne, la séquence d'insertion IS6110 est trouvée en amont de phoP (Perez et al. Molec. Microbiol., sous presse) à quelques paires de bases, suggérant une régulation différente de ce gène chez cet isolat clinique et qui pourrait conduire à une souche plus virulente donc plus transmissible, contrairement à la plupart des souches de M. tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques.
Le vecteur te/sacB a également permis de construire des banques de mutants de transposition de M. bovis BCG et M. tuberculosis. Une première banque de 7000 souches dérivées de M. tuberculosis avait été ordonnée et utilisée pour rechercher par PCR des mutations dans des gènes candidats. Une seconde banque de 4000 souches avait été obtenue en utilisant un transposon marqué. Celle-ci a permis d'utiliser la méthode STM (" Signature-tagged Transposon Mutagenesis ") pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 2000 souches ont été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris. Seize mutants atténués ont été sélectionnés et les mutations qu'ils contiennent caractérisées. Quatre mutants sont retrouvés dans une région génétique de cinquante kilobases regroupant treize gènes impliqués dans la synthèse et le transport des dimycoserosates de phtiocerols. L'analyse des transcrits par RT-PCR a confirmé l'analyse in silico suggérant que ces gènes sont regroupés en trois opérons. Un mutant affecte le gène fadD26 au début de l'opéron responsable de la synthèse des phtiocérols inhibant leur synthèse. Deux gènes drrC et mmpl7 affectent leur transport. Il est interessant de noter qu'il faut des transporteurs de deux familles différentes, des transporteurs ABC et des perméases RND pour la translocation de ces molécules à travers l'enveloppe bactérienne. L'analyse biochimique réalisée en collaboration avec l'équipe de Mamadou Daffé de l'IPBS à Toulouse a permis de montrer que ces molécules sont synthétisées dans le cytoplasme puis transloquées dans la paroi. Le défaut de synthèse ou de transport des dimycosérosates de phtiocerols affecte la perméabilité de l'enveloppe bactérienne et sa structure. La perméabilité au chenodesoxycholate (une petite molécule hydrophobe chargée négativement et capable de diffuser à travers les couches lipidiques) est considérablement augmentée chez les mutants de synthèse ou de transport de ces molécules ainsi que la sensibilité au détergent SDS (Camacho et al., J. Biol; Chem., sous presse). Le rôle des dimycosérosates de phtiocerols dans la virulence de M. tuberculosis pourrait être lié à une imperméabilité de la paroi à des produits toxiques de l'hôte ou à l'interaction de ces molécules avec des cibles de l'hôte qu'il reste à déterminer.


Analyse fonctionnelle de facteurs de virulence (Jean-Marc Reyrat)

L'utilisation de gène rapporteur (phosphatase alcaline), de la mutagénèse insertionnelle étiquetée, ou bien encore de l'outil informatique ont permis d'identifier un certain nombre de gènes de virulence. Plusieurs loci de virulence sont actuellement à l'étude dont Rv1395 un activateur de transcription de la famille AraC/XylS et Erp (Rv3810) une protéine secrétée par M. tuberculosis.

Erp est une protéine secrétee par les bactéries du complexe tuberculosis identifiée grâce à la méthodologie de la phosphatase alcaline. Chez M. tuberculosis, l'inactivation du gène erp par échange allélique a conduit à une atténuation majeure de la virulence aussi bien in vitro, en utilisant des cellules macrophagiques en culture, qu'in vivo dans le modèle murin de la tuberculose. Nous avons récemment montré que Erp est une protéine ubiquitaire des mycobactéries. Cette protéine secrétée est constituée de trois domaines. Le domaine central consiste en une répétition en tandem du motif PGLTS. Cette région centrale est le domaine le plus variable entre espèces : de 4 répétitions dans le cas de M. leprae et jusqu'à 24 pour M. xenopi (De Mendonça-Lima L. et al. MICROBIOLOGY., sous presse). Une analyse de la région génomique encadrant le gène erp montre que celui-ci se situe dans une région comprenant principalement des gènes de biosynthèse de la paroi. Nous analysons à l'heure actuelle le rôle de Erp dans la structuration de la paroi mycobactérienne et le rôle éventuel du nombre de répétitions PGLTS dans la virulence de M. tuberculosis.

Un autre aspect du projet concerne la sécrétion chez les mycobactéries. En effet, un certain nombre de facteurs de virulence ou d'antigène sont présents à la surface du bacille ou bien dans le milieu extra-cellulaire. En utilisant la nucléase de Staphylococcus aureus en tant que gène rapporteur, nous avons pu montré que cette protéine est sécrétée dans le milieu extracellulaire indépendamment de la présence d'une signal-séquence. Des marqueurs cytoplasmiques ont montré que ce phénomène était indépendant de l'autolyse bactérienne. Ces résultats suggèrent l'existence d'une voie de secrétion indépéndante de la voie générale qui reste a être caractérisé.


BCG et autres vaccins dérivés du BCG (Nathalie Winter)

Mycobactérium bovis BCG, vaccin vivant atténué, confère un certain niveau de protection contre la tuberculose et la lèpre. Sa capacité à persister dans les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles telles que le macrophage (MP) ou la cellule dendritique (CD), en font un immunogène attractif pour pour le développement de vaccins efficaces à long terme. Grâce au développement d'outils génétiques, notamment dans notre laboratoire, il est possible d'introduire des gènes hétérologues dans le BCG et de construire des souches de BCG recombinantes (rBCG). Nous étudions le potentiel vaccinant chez le macaque cynomolgus, de souches de rBCG exprimant des gènes du virus de l'immunodéficience simienne VISmac251. En effet, le macaque infecté par VISmac251 développe une pathologie proche du SIDA humain permettant donc d'évaluer de nouveaux candidats vaccins contre VIH. Le gène nef impliqué dans la régulation du cycle viral et les gènes structuraux gag (p26) et env de VISmac251 ont été exprimés dans le BCG. Dans le modèle murin, ces trois souches ont induit des réponses immunitaires de type cellulaire et humoral après administration par voie parentérale ou mucosale.

L'étude de l'immunogénicité du mélange de ces trois souches de rBCG chez le macaque a été entreprise. Les animaux ont été inoculés par voie intradermique, la voie classique d'administration du BCG chez l'homme, puis un rappel par voie muqueuse (orale ou rectale) a été administré. Les réponses immunitaires cellulaires induites ont été testées dans les cellules mononuclées du sang périphérique (CMSP). Une réponse de type lymphocyte T cytotoxique dirigée contre les antigènes Gag et Env a été détectée chez la plupart des animaux vaccinés par le mélange rBCG. Cette lyse s'est accompagnée d'une forte production d'IFNg, indiquant qu'une réponse de type Th1/Tc1 avait été induite. Après le rappel muqueux, les taux de lyse spécifique ont également augmenté. Bien qu'une forte prolifération des CMSP contre les antigènes mycobactériens (PPD) ait été observée, aucune lymphoprolifération en réponse aux antigènes de VISmac251 n'a été détectée après administration de rBCG. Après une inoculation d'épreuve par le virus VISmac251 administrée par voie rectale, une réponse anamnestique contre l'antigène Gag a été detectée chez plusieurs animaux ayant reçu l'immunisation rBCG. La présence de virus a été detectée chez tous les animaux après l'épreuve. Cependant, un animal sur les quatre ayant reçu le rappel rBCG par voie rectale a contrôlé complètement la charge virale. Ces résultats encourageants indiquent que des souches de rBCG sont capables d'induire un certain degré de protection contre une épreuve virulente par VISmac251. Ces études ont été effectuées en collaboration avec les équipes de R. Legrand (CEA, Fontenay-aux-Roses) et de A. Venet (Faculté de Médecine Paris Sud).

Parallèlement à cette première étude, de nouveaux vecteurs d'expression visant à améliorer la stabilité des souches de rBCG ont été développés. L'utilisation de vecteurs intégratifs a permis d'obtenir des souches de rBCG génétiquement parfaitement stables in vivo, dans le modèle murin. En corrélation avec l'expression forte et persistante des gènes hétérologues après immunisation par ces souches intégratives, des réponses immunitaires cellulaires et humorales de plus forte intensité et plus durables que celles observées après immunisation par des souches de rBCG portant des plasmides réplicatifs ont été observées.

Le laboratoire s'intéresse également aux mécanismes d'induction de la réponse immunitaire après administration du vaccin BCG. Dans ce contexte, il parait important d'étudier l'intéraction entre BCG et cellules dendritiques (CD), les seules cellules présentatrices d'antigène professionnelles capables d'activer les lymphocytes T naïfs. Plusieurs travaux ont été entrepris sur ce sujet, notamment in vitro après mise au point de la technique d'obtention de cellules dendritiques à partir de précurseurs de moëlle osseuse murine. En collaboration avec Eric Prina et Jean-Claude Antoine (Unité d'Immuno Physiologie et Parasitisme Intracellulaire) la caractérisation de la vacuole de phagocytose du BCG dans la CD a été entreprise afin de mieux appréhender les mécanismes de présentation des antigènes mycobactériens aux lymphocytes T dans les temps précoces.


ENSEIGNEMENT
L'Unité est un laboratoire d'accueil du "Marie Curie Host Fellowship" de la Commission Européenne. "Unravellling Mycobacterium pathogenicity. MCFH-1999-00615". http://www.cordis.lu/improving/

RÉSEAUX INTERNATIONAUX
L'unité fait partie des réseaux suivants de la commission européenne :


  1. "A cluster for tuberculosis vaccine development" (N° QLK2-CT-1999-01093). http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/

  2. " Mucosal Immunization — Cluster Project ", (N° QLK2-CT-1999-00228).

  3. " New generation genetic markers and techniques for the epidemiology and control of tuberculosis " (N° QLK2-CT-2000-00630).

  4. " New strategies for treatment and prevention of mycobacterial diseases " (N° QLK2-CT-2000-01761).

  5. " Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America ", (N° ICA4-CT-2000-30032 (INCO-DEV).

  6. " Mucosal immunization- Cluster project", (N° QLK2-CT-1999-00228).

  7. "Improved diagnosis, drug resistance detection and control of tuberculosis in Latin America".Projet (N°: ICA4-2000-10054).

  8. "Structural and functional genomics of M. tuberculosis", (N° QLRT-2000-02018).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

SINNO Helena, secrétaire de direction IP

GICQUEL Brigitte, Professeur I.P.

GUILHOT Christophe, CR 2 IP

REYRAT Jean-Marc, CR 2, INSERM

WINTER Nathalie, CR 2 IP

BEN AMOR Yanis, étudiant en DEA

BOURGUIN Isabelle, stagiaire post-doctorant

CAMACHO Luis Reinaldo,, étudiant en thèse

EBRAHIMI RAD Mina, stagiaire post-doctorant

FERNANDEZ BOECHAT Neio, MD, étudiant en thèse

JACKSON Mary, boursière Roux I.P.

MARTINEZ Valérie, MD, étudiante en thèse

DE MENDONCA LIMA Leila, stagiaire post-doctorant

MEDERLE Isabelle, étudiante en thèse

RAYNAUD Catherine, stagiaire post-doctorant

RECCHI Chiara, étudiante en thèse

ROUSSEAU Cécile, étudiante en thèse

SUPPLY Philip, stagiaire post-doctoral

AUBERT-PIVERT Elisabeth, ingénieur IP

CHARLES Patricia, agent technique d'exploitation I.P.

ENSERGUEIX Danielle, technicienne supérieure I.P.

RAUZIER Jean, technicien supérieur I.P.


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