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  Responsable : ROUGEON François (frougeon@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de notre laboratoire sont centrés autour de deux axes principaux : (i) l'analyse des mécanismes moléculaires conduisant à l'expression clonale des immunoglobulines dans les lymphocytes B ; (ii) l'analyse des mécanismes qui contrôlent au niveau transcriptionnel et post-traductionnel l'expression de la rénine et de polypeptides propres à la glande sous-maxillaire des rongeurs.



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1. Régulation de la recombinaison V(D)J des gènes des immunoglobulines (Michele Goodhardt)

L'expression des gènes codant pour les immunoglobulines (Ig) et le récepteur des cellules T nécessite l'assemblage préalable de l'exon variable, à partir de segments géniques distincts, V, D et J. Ces événements de recombinaison site-spécifique, qui ont lieu dans les précurseurs des lymphocytes B et T, sont régulés au cours du développement des cellules lymphocytaires et sont spécifiques de la lignée B ou T.


Afin d'identifier les éléments impliqués dans la régulation du réarrangement des gènes des Ig, nous avons construit des souris transgéniques portant différentes constructions de gènes de chaîne légère k non réarrangés. Ces expériences ont mis en évidence deux types d'éléments intervenant dans la régulation du réarrangement des gènes k : d'une part, des séquences activatrices associées à l'enhancer intronique, qui induisent la recombinaison et d'autre part, des séquences de type silencer localisées dans la région intersegmentaire Vk-Jk qui confèrent la spécificité du réarrangement en restreignant la recombinaison aux précurseurs B. Nous avons également étudié la structure chromatinienne des segments V et J des gènes de chaînes lourdes et légères, dans des précurseurs pro B et pre B de souris RAG2 -/- déficientes en recombinaison V(D)J. Nos résultats indiquent que des modifications de la structure chromatinienne des gènes des Ig précèdent la recombinaison V(D)J au cours de la différentiation des cellules B. L'initiation des réarrangements est associée à un remodelage de la chromatine des segments V et J, tandis que l'arrêt des réarrangements implique uniquement des changements de structure chromatinienne des segments V.


2. Expression de la terminale transférase au cours du développement (Noëlle Doyen)

La terminale déoxynucléotidyl transférase (TdT) est une enzyme impliquée dans la génération de la diversité des immunoglobulines et des récepteurs T, puisqu'elle est responsable de l'addition de nucléotides aléatoires, dits N, aux jonctions formées au cours de la recombinaison entre les segments géniques V, D et J. Absente au cours de la vie foetale, la TdT n'est exprimée que quelques jours après la naissance.

Nos travaux sont centrés autour de deux axes : l'étude des mécanismes responsables de l'expression différentielle de la TdT dans les lymphocytes T et B au cours du développement. Nous avons entrepris de caractériser les régions régulatrices et les facteurs de l'environnement impliqués dans le contrôle transcriptionnel du gène de la TdT. De plus, en étudiant la réponse immune à différentes stimulations antigéniques dans un modèle de souris transgénique exprimant la TdT, dès le stade fœtal,
nous cherchons à préciser le rôle de la régulation temporelle de la diversité N dans le système immunitaire.


3. Analyse in vitro des protéines partenaires de la recombinaison V(D)J (Catherine Papanicolaou)

Nous avons poursuivi l'exploitation de notre méthode de production de protéines hétérologues chez E. coli (DB/MD-99/112). Nous avons obtenu les deux isoformes de TdT murine, une TdT délétée du tiers N-terminal et néanmoins active (TdTdelta130), les protéines RAG1 et RAG2 entières ainsi que les protéines HMG1 et HMG2 : (i) nous avons comparé les deux TdT murines et montré que dans l'isoforme longue la présence d'une insertion de vingt acides aminés dans une région très conservée modifie la susceptibilité à la chaleur mais pas l'activité catalytique ; (ii) nous avons, en collaboration avec Marc Delarue (Unité d'Immunologie Structurale), obtenu des cristaux de la TdTdelta130 et un jeu de données de diffraction à 2.3 angströms ; (iii) nous avons étudié la discrimination de la TdT entre ribo et déoxyribonucléotides ; (iv) nous avons identifié par mutagénèse un résidu aspartate essentiel pour l'activité catalytique de la TdT et étendu notre analyse de variants de la TdT afin d'étudier ses mécanismes de sélection pour les substrats ADN simple brin et nucléotides ; (v) nous avons poursuivi la mise en place d'un système de recombinaison acellulaire avec des protéines non tronquées.


4. Caractérisation d'un nouveau modulateur peptidique (SMR1- Pentapeptide) (Catherine Rougeot)

Un ARNm majoritaire de la glande sous-maxillaire (GSM) du rat mâle adulte, codant pour une protéine nommée SMR1 (Submandibular Rat 1) a été caractérisé. Nous avons montré que la protéine SMR1 a les caractéristiques structurales et fonctionnelles d'un précurseur hormonal. Sa maturation conduit in vivo à la libération d'un peptide nommé SMR1-pentapeptide (SMR1-QHNPR). La sécrétion locale et systémique de ce peptide est sujette à une régulation différentielle dépendant de l'organe (GSM, prostate), du taux circulant des hormones gonadiques (androgènes) et des conditions de stimulation par le système nerveux sympathique (adrénaline).

L'ensemble des données de post-génomic intégrative accumulées dans le laboratoire depuis dix ans ont révélé que le peptide, SMR1-Pentapeptide, est un nouveau médiateur peptidique de signalisation extra-cellulaire. Il est mobilisé dans certaines situations de stress, afin d'assurer in vivo la coordination des composants de la réponse comportementale végétative, motrice et sexuelle et particulièrement ceux impliquant les réponses nociceptive, vasoactive, inflammatoire et homéostatique minérale, chez le rat.


5. Régulation et évolution du gène codant le précurseur SMR1 (I. Rosinski-Chupin)

L'expression du gène codant SMR1 est induite par les androgènes dans la glande sous-maxillaire (GSM) du rat. Grâce à une démarche principalement basée sur l'hybridation in situ, nous avons montré qu'en conditions physiologiques de faibles concentrations en androgènes, l'expression de SMR1 est hétérocellulaire, au sein de la population de cellules acineuses de la GSM. Les androgènes induisent l'expression du gène SMR1 dans les cellules acineuses précédemment silencieuses, ainsi que l'augmentation de la quantité d'ARNm SMR1 par cellule. L'amplitude finale de la réponse aux androgènes est déterminée par la combinaison de ces deux niveaux de régulation. Notre hypothèse de travail est qu'en absence d'androgènes, le gène SMR1se situe dans un contexte chromatinien répressif pour la transcription et nous cherchons actuellement à préciser les changements de structure chromatinienne associés à la réponse aux androgènes.

Par ailleurs, le gène codant SMR1 appartient à une famille multigénique que nous avons caractérisée en partie chez la souris et le rat et, plus récemment, chez l'homme. Nous cherchons par ailleurs à préciser les événements qui ont abouti à la diversification des gènes de cette famille au cours de l'évolution.


6. Les aspects mécaniques du processus de mutation somatique dans les régions variables des gènes des immunoglobulines humaines (Brid Laoide)

Les mutations somatiques sont restreintes à une période très brève du développement de la lignée lymphocytaire B. Elles sont introduites à l'intérieur des centres germinaux des organes lymphoïdes secondaires, de manière ciblée et régulée dans les gènes réarrangés des immunoglobulines. Notre objectif est d'identifier l'agent mutateur responsable de ce processus. Cette recherche sera menée dans le cadre de l'intérêt de l'Unité dans l'évolution des aspects mécaniques de la diversification des séquences chez les vertébrés (gnathostomes).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BOUTOUT Laurence, IP, lboutout@pasteur.fr

ROSINSKI-CHUPIN Isabelle, IP, Email : ichupin@pasteur.fr

DOYEN Noëlle, IP, E-mail : ndoyen@pasteur.fr

GOODHARDT Michèle, CNRS, E-mail : migood@pasteur.fr

LEFEVERE-LAOIDE Brid, IP

PAPANICOLAOU Catherine, CNRS, E-mail : papanico@pasteur.fr

ROUGEON François, CNRS/IP, E-mail : frougeon@pasteur.fr

ROUGEOT Catherine, IP, E-mail : crougeot@pasteur.fr

BOULE Jean-Baptiste, Thèse, E-mail : jbboule@pasteur.fr

CHERRIER Marie, Thèse, E-mail : cherrier@pasteur.fr

COQUILLEAU Isabelle, Thèse, E-mail : icoq@pasteur.fr

HUAULME Jean-François, Thèse, E-mail : jhuaulme@pasteur.fr

MAES Jérôme, Thèse, E-mail : jmaes@pasteur.fr

CAVELIER Patricia, CNRS, E-mail : cavelier@pasteur.fr

KLIMCZAK Martine, IP, E-mail : mfanton@pasteur.fr

RIGAULT Anne-Gaëlle (remplaçante de Véronique HERMITTE à partir du 27/11/00), IP, E-mail : arigault@pasteur.fr


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