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  Ecoentomo


  Responsable : Jean-François Charles depuis le 27 Octobre 2000 (antérieurement, Bernard Papierok) (jcharles@pasteur.fr)


  resume

 

En 2000, l'étude du mode d'action des toxines de Bacillus sphaericus (relations structure / fonction, formation de canaux dans des membranes artificielles), et leur récepteurs chez les larves du moustique Culex pipiens (clonage et expression fonctionnelle dans des hôtes hétérologues, implications dans les mécanismes de résistance à ces toxines) a été poursuivie.
Un second volet a porté sur la recherche de nouvelles toxines actives sur moustiques, ainsi que sur l'amélioration des potentialités de B. sphaericus par la co-expression d'autres toxines.
Une nouvelle thématique a été abordée, portant sur les bases moléculaires des interactions moustiques-arbovirus (Aedes sp. / dengue et fièvre jaune).
Les bases moléculaires de la bio-diversité en fonction de l'origine de l'hôte ont été étudiées pour les champignons entomopathogènes.



  rapport

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A. Recherche

1. Les récepteurs des toxines de Bacillus sphaericus sur les larves de moustiques (Jean-François Charles, Christina Nielsen-LeRoux)

Chez les larves de Culex pipiens, un récepteur spécifique de la toxine binaire (Bin) de Bacillus sphaericus est présent sur les membranes intestinales. Ce récepteur (une alpha-glucosidase de 60kDa) a été cloné et exprimé de manière hétérologue dans des cellules d'insectes (Sf9), en collaboration avec une équipe de l'INRA d'Antibes. D'autre part, le clonage et l'expression en cellules Sf9 du récepteur homologue provenant d'une colonie de C. pipiens résistante à la toxine a été effectué. L'étude de leurs fonctionnalités respectives (encore en cours) mettent en évidence la nécessité de leur ancrage membranaire (du type GPI) dans leur rôle de récepteur.


2. Canaux formés par la toxine binaire de B. sphaericus(Jean-François Charles)

En collaboration avec une équipe du National Research Council de Montréal, nous avons mis en évidence que le composant BinA de la toxine binaire est capable de s'insérer dans des membranes artificielles phospholipidiques, et d'y former des pores, confirmant ainsi son rôle présumé de composant actif de la toxine, la partie BinB étant quant à elle responsable de la fixation sur le récepteur spécifique.


3. Structure/fonction la toxine binaire de B. sphaericus (Jean-François Charles, Christina Nielsen-LeRoux)

Une toxine Bin, mutante naturelle non toxique, ayant été identifiée, les raisons de l'absence d'activité larvicide ont été recherchées. La non toxicité n'est pas due à une absence de liaison au récepteur, mais à une mutation sur le composant BinA en position 93, qui, lorsqu'elle est reversée, permet de restaurer l'activité toxique sur les larves de C. pipiens.


4. Résistance des larves de moustiques à Bacillus sphaericus et identification de nouveaux facteurs toxiques (Christina Nielsen-LeRoux)

Plusieurs populations de C. pipiens ont développé des résistances à la toxine binaire de B. sphaericus. Le mécanisme de résistance implique soit une modification de l'étape de liaison (toxine -récepteur) soit un mécanisme inconnu se situant à priori après l'étape de liaison. Nous avons pu mettre en évidence que deux mécanismes de résistance différents peuvent cohabiter dans des populations géographiquement proches (région de Montpellier). La résistance à B. sphaericus a été jusqu'à présent déterminée comme récessive, mais une colonie originaire de l'Inde semble exprimer la résistance de manière dominante.
Deux souches naturelles de B. sphaericus ayant une activité toxique sur les larves résistantes, leur potentiel dans la gestion de la résistance et l'identification d'autres facteurs toxiques sont en cours d'étude. L'utilisation d'une des souches, en raison de la présence de ces facteurs, retarderait l'apparition de la résistance. Le nouveau facteur (potentiellement) toxique est en cours de clonage.


5. Recherche de nouvelles toxines actives sur les larves de Diptères (A. Delécluse)

Objectif : identifier et caractériser de nouvelles toxines actives sur les larves de moustiques, qui pourraient remplacer les toxines actuellement utilisées.
Deux gènes codant de nouvelles toxines (Cry29A et Cry30A) de Bacillus thuringiensis medellin avaient été clonés et séquencés au laboratoire. L'expression de chacun de ces gènes a été réalisée et des inclusions constituées des protéines Cry29A ou Cry30A ont été purifiées. L'activité biologique de ces inclusions a été déterminée : les protéines Cry29A et Cry30A ne sont pas actives seules sur les larves de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens et Anopheles stephensi, mais semblent agir en synergie avec d'autres toxines de Bt medellin, sur ces trois espèces, contribuant ainsi à une meilleure toxicité des cristaux de la souche naturelle.
Un gène codant une cytolysine (Cyt2Bc) de Bt medellin ayant auparavant été isolé et séquencé au laboratoire, l'activité biologique (larvicide et hémolytique) des inclusions ne contenant que cette protéine Cyt2Bc a été déterminée. Cette protéine est toxique pour les 3 espèces de moustiques et présente une activité hémolytique après activation par la trypsine.


6. Résistance des larves de moustiques aux nouvelles toxines (A. Delécluse)

Objectif : rechercher, parmi les nouvelles toxines identifiées, celles qui permettraient de prévenir ou contourner la résistance aux toxines déjà utilisées.
En collaboration avec M. Wirth (Université de Riverside, Californie), une étude de résistance croisée entre les nouvelles toxines identifiées et celles déjà utilisées a été entreprise. Trois toxines de B. thuringiensis (Cyt1Ab, Cyt2Ba et Cry19A) se sont révélées toxiques sur des larves de C. quinquefasciatus résistantes aux toxines de B. sphaericus ou Bt israelensis.


7. Amélioration des potentialités de B. sphaericus (V. Juárez-Pérez, M. Porcar, A. Delécluse)

Objectif : augmenter l'activité insecticide et le spectre d'action de B. sphaericus en introduisant chez cet organisme les gènes codant les nouvelles toxines les plus actives.
Un organisme recombinant synthétisant la protéine Cry11Ba de Bt jegathesan avait été précédemment construit. Malgré la faible production de cette protéine, le recombinant s'était avéré toxique sur des larves d'A. aegypti (contrairement à la souche parentale) et sur des populations de C. quinquefasciatus résistantes à la souche parentale de B. sphaericus. Afin d'augmenter l'expression du gène cry11Ba et de rendre ainsi les clones recombinants plus toxiques, nous avons recherché des séquences promotrices fortes de B. sphaericus. Dix séquences ont ainsi été caractérisées; la construction d'un recombinant comprenant un promoteur fort situé en amont du gène cry11Ba est en cours.


8. Bases moléculaires des interactions moustiques-arbovirus (A. Delécluse, V. Juárez-Pérez)

La plupart des objectifs fixés pour le travail présenté ci-dessus ayant été atteints, nous avons décidé d'initier une nouvelle thématique plus directement liée à la santé publique et intitulée "Bases moléculaires des interactions moustiques-arbovirus". Cette thématique, qui fait l'objet d'un PTR et d'un financement de l'OMS, a pour objectifs de : 1) définir les mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission de certaines arboviroses (dengue et fièvre jaune dans un premier temps) par les moustiques et 2) étudier l'évolution du génome de la dengue lors de sa réplication chez le moustique.


9. Présence de B. thuringiensis dans la nature (Christina Nielsen-LeRoux, Isabelle Thiéry)

En collaboration avec l'Entente Interdépartementale pour la Démoustication (EID Mediterranée, Montpellier), nous avons été impliqués dans l'évaluation de la présence en milieu naturel de B. thuringiensis, dans le but de déterminer si à la suite de traitements avec B. thuringiensis israelensis il y accumulation de spores viables dans l'environnement. Ce projet fait partie du programme LIFE (de l'Union européenne).


10. Champignons entomopathogènes (Bernard Papierok)

Les travaux sur les champignons entomopathogènes ont porté sur l'exploration de leur diversité, que ce soit sur le terrain (mise en évidence d'associations non encore décrites entre des Entomophthorales et des Homoptères lors de prospectives réalisées au Sénégal et en Guinée), ou au laboratoire (utilisation de méthodes moléculaires en vue de préciser, pour le genre Erynia, les relations au niveau inter- et intra-spécifique en fonction de l'origine géographique et de l'hôte).


B. Centre Collaborateur OMS / Collection IEBC (Jean-François Charles)
(voir aussi
www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/bentomo-index.html)

Le laboratoire héberge le Centre Collaborateur de l'OMS en matière de bactéries sporulées entomopathogènes pour la lutte biologique contre les vecteurs de maladies. À ce titre, il a identifié en 2000, par sérotypie (sur la base des antigènes flagellaires H), par utilisation de caractères biochimiques et, le cas échéant, par comparaison des profils polypeptidiques d'inclusions parasporales, 160 souches originaires principalement d'Amérique du Sud, d'Afrique du Nord, de Corée et d'Inde. Plus des 2/3 de ces souches appartenaient à l'espèce B. thuringiensis.
La Collection Internationale des Bacillus entomopathogènes (Collection IEBC) contient actuellement plus de 6000 souches, réparties de la façon suivante : 3600 B. thuringiensis, 600 B. sphaericus et 1800 autres Bacillus. Le laboratoire a procédé également à l'évaluation de l'activité, à l'égard des larves de plusieurs espèces de moustiques, des souches reçues pour identification et de produits adressés pour expertise.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Marie-France Blanc

Jean-François Charles (IP)

Bernard Papierok (IP)

Armelle Delécluse (IP)

Christine Nielsen-Le Roux (IP)

Philippe Laurent (CNRS)

Victor Juarez, Postdoc

Manel Porcar, Postdoc

Patricia Vary, Professeur, Northern Illinois University, USA

Chantal Francis, étudiante en DESS Biotechnologie, Université Victor Segalen, Bordeaux

Myriam Hajaij, étudiante en thèse, Faculté des Sciences de Tunis

Jérôme Prêtre, étudiant en licence, Faculté de Franche-Comté, Besançon

Isabelle Thiéry

Sylviane Hamon

Sylvie Brémont

Huguette Ripouteau

Nelly Delattre

Vidalia Patricio

Anne-Marie Fillodeau

Christine Viley


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