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  Responsable : FREITAS Antonio (afreitas@pasteur.fr)


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L'Unité de Biologie des Populations Lymphocytaires a comme objectifs: a) étudier les mécanismes d'homéostasie; b) étudier les dynamiques des populations lymphocytaires: taux de production de survie et mort cellulaire, ainsi que les taux de renouvellement de ces populations; c) étudier le rôle de la compétition cellulaire dans la sélection lymphocytaire et dans le contrôle de la réponse immunitaire. d) étudier les mécanismes d'induction et persistance de la mémoire immunologique.



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I. Homéostasie lymphocytaire Cellules B. (Fabien Agenes & Manuela Rosado).

Chez la souris adulte, le nombre de cellules demeure constant malgré la production continue de nouvelles cellules dans la moelle osseuse (MO). Les mécanismes déterminant le nombre de lymphocytes et comment ce nombre est atteint, dans des conditions physiologiques normales, restent incompris. Nous avons utilisé des souris déficientes en cellules B, présentant un arrêt de la production cellulaire B aux stades pro et pré-B de la différentiation cellulaire, afin d'étudier la possibilité qu'un nombre limité de précurseurs B normaux peuplent les compartiments périphériques B. A partir de ces souris déficientes, nous avons établi des chimères reconstituées avec des mélanges de cellules de MO provenant de donneurs normaux et déficients en cellule B. Nous avons montré que le nombre physiologique de cellules périphériques B n'était pas déterminé par le nombre de précurseurs B. Les souris possédant moins de 25% du nombre normal de pré-B avaient des quantités de cellules B périphériques réduites. Toutefois, un compartiment B périphérique de taille normale était généré dans les souris possédant seulement 30% du nombre normal de pré-B. Ces résultats montrent qu'environ 1/3 des précurseurs de cellules B de MO suffit à maintenir la taille du compartiment B périphérique. Nous avons obtenu une conclusion analogue après parabiose entre une souris normale et deux ou trois souris déficientes en cellules B. Dans ce cas, la production B était limitée à la MO de la souris normale et aucun chimérisme n'a pu être détecté dans la MO des différents animaux. Nous avons trouvé, dans ces groupes de souris, que chaque individu présentait un nombre de cellules B physiologique, c'est-à-dire que la production B d'une souris était suffisante pour peupler les compartiments périphériques de 3 souris. Ces résultats montrent que la quantité de cellules B périphériques n'est pas déterminée par les taux de production de cellules B dans la MO mais qu'elle est limitée à la périphérie.

Nous avons aussi montré dans ce même groupe de chimères, que le compartiment de cellules B activées sécrétrices d'IgM était contrôlé par des mécanismes homéostatiques autonomes, le nombre de cellules qu'il comprend étant régulé indépendamment de la taille du compartiment de cellules B matures au repos. Ces résultats corroborent le modèle du système immunitaire dans lequel la taille des différents compartiments B (pré-B, cellules B au repos et sécrétrices d'IgM) est régulée de façon autonome. Ils suggèrent une organisation hiérarchique dont la première priorité est le maintien des taux d'IgM sériques normaux pour assurer une première barrière naturelle de protection tout en gardant un maximum de diversité du répertoire dans le compartiment B au repos.
Dans un système immunitaire avec un surplus continu de production B et un nombre total de cellules B constant, chaque cellule B nouvellement produite ne peut s'établir qu'avec la perte d'autres cellules. Le maintien de cellules B à la périphérie pourrait toutefois être modifié par l'arrivée continue d'émigrants de la MO nouvellement formés de même que le devenir de ces derniers à la périphérie pourrait aussi être dépendant de la présence ou l'absence de populations B résidentes. Nous avons étudié les éventuelles influences mutuelles entre les populations établies de cellules B et les migrants B nouvellement formés. Les questions abordées lors de ces études sont : Quel est le rôle de la production B dans le renouvellement des cellules B périphériques et y a-t-il des mécanismes de rétrocontrôle régulant l'entrée de nouvelles cellules B dans les compartiments B périphériques? Pour répondre à ces questions, nous avons comparé : 1) la persistance des cellules B périphériques en présence ou absence de production de nouvelles cellules B de MO. Pour cela, nous avons étudié le devenir des cellules B matures au repos transférées seules ou simultanément avec un compartiment de précurseurs dans une souris immunodéficiente (Rag2-/-); 2).Nous avons comparé le devenir d'une population B (d'émigrants récents de la MO ou des cellules B matures) en présence d'une population B périphérique déjà établie. Dans ce cas, nous avons suivi l'émergence et la persistance d'une deuxième population B dans des souris déficientes en cellules B qui avaient été injectées avec un groupe de cellules B matures. Nos résultats corroborent la notion que la régulation homéostatique des compartiments au repos et celui des cellules B activées est autonome, ceci indiquant que les deux populations B appartiennent à des niches immunologiques différentes.
Une population de cellules B établies peut-elle modifier le devenir de nouveaux émigrants B à la périphérie? La réponse est oui. Nous avons montré qu'en présence d'une population établie de cellules B activées, il y a une diminution dans la production d'IgM par une population B introduite ultérieurement. Ces résultats montrent qu'il y a des mécanismes de rétrocontrôle régulant la différentiation terminale B et le nombre total de cellules B activées.
En conclusion, nous avons montré que les cellules B restantes, après deux semaines de transfert chez des hôtes immunodéficients, représentent une population B stable qui persiste longtemps par auto-renouvellement, qui résiste au remplacement et qui peut modifier le sort des cellules B nouvellement formées. Ces résultats suggèrent que la priorité du système immunitaire est la production d'un taux " normal " d'IgM circulant afin d'assurer une première barrière de protection contre l'infection et que dès qu'une cellule B particulière est sélectionnée, elle peut être conservée par le système.


Cellules T. (Afonso Almeida, Jose Borghans & Nicolas Legrand).

Nous avons développé une nouvelle stratégie permettant une évaluation quantitative de la contribution de la production T thymique, l'établissement et le maintien des compartiments périphériques T. Nous avons étudié la capacité d'un nombre limité de précurseurs T à peupler les compartiments périphériques T. Nous avons utilisé des souris déficientes T TCRa-/-, CD3e-/- et Rag2-/- présentant un arrêt développemental de la production T afin d'établir des chimères contenant différentes quantités de cellules précurseurs compétentes. Des souris B6.Rag2-/- alymphophéniques irradiées létallement ont été reconstituées avec des cellules de MO (déplétées en cellules T) provenant de donneurs normaux B6.Ly5a seules ou de souris normales B6.Ly5a et B6.Ly5b déficientes T mélangées à différents taux. Dans les chimères obtenues, les précurseurs compétents de Ly5a normaux étant dilués dans les précurseurs mutants incompétents Ly5b, le taux de production cellulaire T dans le thymus devrait varié selon la part de cellules compétentes Ly5a présentes dans l'inoculum de MO initial.
Dans les chimères issues de mélanges B6.Ly5bTCRa-/-/B6.Ly5a, le nombre total de thymocytes DP, composés de cellules compétentes et incompétentes, était identique dans toutes les chimères étudiées. Toutefois, le nombre de cellules compétentes DP Ly5a, augmentait avec le nombre de cellules compétentes DN présentes dans le thymus. Le nombre de cellules compétentes DP était proportionnel, de façon linéaire, à celui des cellules compétentes DN, c'est-à-dire qu'un nombre deux fois inférieur de cellules compétentes DN résultait en un nombre deux fois inférieur de cellules compétentes DP. En conclusion, nos résultats indiquent que la taille du compartiment DP est déterminée par l'influx des cellules du compartiment DN, ce qui suggère que, chez la souris normale, le nombre de précurseurs DN détermine strictement le nombre de cellules DP. Dans le thymus de toutes les chimères de déficientes T/normales, le nombre de cellules TCRhighSPCD4 ou TCRhighSPCD8 était proportionnel à celui des cellules compétentes DP. Un nombre deux fois inférieur de cellules compétentes DP engendrait un nombre deux fois inférieur de cellules matures SP TCRhigh récupérées du thymus.

Nous avons étudié la taille des compartiments périphériques T CD8 et CD4 chez des souris avec une exportation et une production cellulaire T du thymus réduite. A l'opposé de ce que nous avons trouvé dans le thymus, le nombre total de cellules CD4 et CD8 à la périphérie n'était pas proportionnel à celui des cellules dans le compartiment précédent, c'est-à-dire des cellules du thymus SPCD4 et SPCD8. Dans la plupart des chimères avec des quantités réduites de cellules SP du thymus, la taille des compartiments périphériques T était identique à celle trouvée dans les chimères avec des nombres normaux de cellules SP du thymus. Une diminution de 100 fois du nombre de cellules SP CD4 et SP CD8 ne réduisait les compartiments périphériques CD4 et CD8 que de 4 et 8 fois respectivement. Cela suggère qu'en présence de faibles taux de cellules T un mécanisme homéostatique compensatoire favorise l'activation et la prolifération cellulaire T jusqu'à atteindre des taux de cellules T périphériques normaux. En accord avec ceci, nous avons trouvé que plus faible était le nombre de cellules périphériques CD8+ ou CD4+, plus grande était la quantité de cellules activées T CD4+CD45RBlow et CD8+CD44+. Ces résultats démontrent que le nombre de cellules périphériques T CD4 et CD8 est déterminée en partie uniquement par les taux de production et exportation cellulaire du thymus. En conclusion, nous avons montré qu'il y a, chez une souris jeune adulte, un excès de production cellulaire du thymus, la plupart des chimères avec de faibles taux de thymocytes SP ayant des quantités normales de cellules T périphériques. Toutefois, l'établissement du compartiment cellulaire T périphérique de taille physiologique nécessite un minimum de production thymique, les chimères avec de très faibles taux de cellules SP du thymus ayant été incapables de reconstituer totalement les compartiments périphériques CD4 et CD8.

Les cellules périphériques T CD4+ sont composées de sous-populations fonctionnellement distinctes. Une population de cellules T CD45RBhighCD25-CD4+ enrichie de cellules naïves représente environ 2/3 des cellules périphériques T CD4 et des populations de cellules activées T CD45RBlowCD25-CD4+ et CD45RBlowCD25+CD4+. On a montré que les cellules activées T CD4+ exercent d'importantes fonctions régulatrices. Nous avons étudié les mécanismes contrôlant l'expansion des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+ et CD45RBlowCD25+CD4+ après transfert chez des hôtes CD3e-/- déficients en cellule T. Nous avons étudié plus particulièrement si les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+, décrites pour exercer une fonction régulatrice, pouvaient aussi diriger l'homéostasie des cellules périphériques T CD4+. Chez les hôtes, les populations T CD4+ proliféraient de façon importante mais, alors que les cellules T CD45RBhighCD25-CD4+ atteignaient l'équilibre avec 1-2x107 cellules, les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ atteignaient des nombres 10 fois plus bas. Des transferts de cellules séquentiels dans ces mêmes hôtes ont confirmé qu'il y avait un contrôle homéostatique de l'expansion des cellules naïves T CD4 et corroboré le rôle de la compétition cellulaire dans ce processus.

Lorsque les deux populations T ont été co-injectées, la présence de cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ a limité l'expansion des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+. Ces effets étaient indépendants du nombre relatif des deux populations cellulaires. La suppression de l'accroissement des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+ était évident lorsque le nombre de cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ dépassait d'un facteur 10 le nombre de cellules T CD45RBhighCD25-CD4+, ceci étant moins perceptible et variable lorsque les deux populations étaient présentes en nombre identique, et absent pour des rapports plus faibles de cellules CD25+/CD25-. Lors des expériences de transfert cellulaire séquentiel, nous avons trouvé que le transfert d'un nombre limité (5x104) de cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ arrêtait la croissance d'une population en expansion de 5x106 cellules résidentes T CD45RBhighCD25-CD4+. Des transferts cellulaires adoptifs de cellules T CD45RBlowCD25+CD4 à des receveurs secondaires ont montré que seules les cellules, qui restent CD25+, ont une capacité suppressive. Quels sont les mécanismes qui font que les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ limitent l'accroissement des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+? Nous avons montré que les cellules CD25+ ne bloquaient pas totalement la division des cellules T CD4+ marquées CFSE mais diminuaient le taux de division cellulaire ou l'accumulation (survie) des cellules en division. Le contrôle de l'expansion des cellules T périphériques par les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ n'est pas médiée par l'IL-10, les cellules de souris déficientes IL-10 étant aussi efficaces que les cellules de donneurs normaux dans la suppression de l'expansion des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+. En conclusion, ces études ont démontré le rôle des interactions cellules T dans le contrôle homéostatique de la taille du compartiment périphérique T CD4+. Les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ agissent en limitant l'accumulation de cellules naïves T CD45RBhighCD25-CD4+ en division, c'est-à-dire qu'elles contrôlent la différentiation des cellules naïves T CD4 et leur passage dans le compartiment cellulaire activé.


II. Compétition Lymphocytaire. (Fabien Agenes, Angela McLean & Manuela Rosado).

Dans un système immunitaire où de nouveaux lymphocytes sont continuellement produits en excès mais où leur quantité totale est maintenue constante, des cellules nouvellement générées doivent, pour survivre, rentrer en compétition avec d'autres cellules nouvellement produites ou des cellules résidentes. La compétition peut être définie comme "une interaction entre deux populations, dans laquelle, pour chacune d'elle les taux de naissance sont diminués ou ceux de mort augmentés par la présence de l'autre population". Il existe deux principaux critères reconnus comme preuve d'une compétition entre populations : 1. La présence de compétiteurs devrait modifier la taille d'équilibre d'une population et 2. La présence de compétiteurs devraient modifier les dynamiques, par exemple la durée de vie d'une population. La question de savoir si la compétition survient entre les cellules B et T a été posée en comparant le développement et le devenir des populations BCR-Tg, TCR-Tg et non-Tg chez différentes lignées de chimères de MO. On a trouvé que : a) lorsqu'elles sont injectées seules, les populations Tg et non-Tg ont un comportement identique et produisent des compartiments périphériques de taille similaire; b) lorsque des cellules Tg et non-Tg sont mélangées dans le même hôte, elles s'accumulent au même taux dans les premiers temps. Toutefois, après avoir atteint un plateau en nombre, il y a une sélection préférentielle des cellules non-Tg à la périphérie. Ces observations répondent au premier critère de compétition en démontrant que la présence de populations non-Tg modifie le nombre de cellules Tg. Par ces expériences, on a aussi trouvé que l'espérance de vie des cellules B et T Tg variait selon la présence et le type d'autres cellules compétitrices. Ces observations répondent au deuxième critère de définition de compétition car elles prouvent que la présence de compétiteurs modifie la durée de vie d'une population.

La compétition peut survenir de différentes manières. Dans la compétition par interférence, les populations peuvent interagir directement entre elles ou une population peut empêcher une autre d'occuper une niche et d'en exploiter ses ressources. Donc, bien que la compétition par interférence puisse survenir pour une ressource, elle est "uniquement liée au niveau de ressource". Dans la compétition par exploitation, différentes populations ont un besoin commun des ressources présentes en quantité limitée. Dans ce cas, la compétition est directement liée au niveau de ressources disponible. Nous devons définir la "ressource" comme tout facteur qui peut conduire à une survie ou croissance cellulaire accrue par certains niveaux de leur disponibilité. Dans un sens large, une ressource est un facteur "utilisé" par une cellule et qui donc n'est plus disponible pour les autres cellules. Dans le système immunitaire, toute molécule peut fonctionner comme une ressource, par exemple, antigène, molécules du CMH, les ligands pour les molécules co-stimulatrices ou d'adhésion, mitogènes, interleukines, chemokines, hormones et autres facteurs de croissance, etc. Les ressources peuvent être externes au système immunitaire ou être produites par les lymphocytes eux-mêmes. En produisant leurs propres ressources, les lymphocytes contribuent aussi à générer leur propre "espace" écologique. Il est maintenant important d'établir une hiérarchie des ressources afin de définir les mécanismes possibles de l'intervention immunitaire.
Nous avons comparé la capacité de reconstitution des cellules B de souris Igk-/- et avons trouvé qu'elles ne rentrent pas en compétition avec les compartiments B périphériques par rapport aux cellules B des souris contrôle, ce qui suggère que la diversité du BCR joue un rôle primordial dans la compétition cellulaire B. Nous avons aussi montré que la surexpression de l'oncogène bcl2 confère un avantage compétitif dans la reconstitution périphérique par les cellules B de donneurs Tg bcl2, ce qui confirme que la survie cellulaire est un facteur important de la compétition cellulaire B. Nous avons aussi étudié le rôle des IgD de surface dans la capacité compétitrice des cellules B en comparant la capacité de reconstitution périphérique et la survie des cellules B de souris IgD-/- et contrôle IgD+ sans différences concluantes. D'autres facteurs sont actuellement examinés.

III. Survie lymphocytaire

Dans un système immunitaire où le nombre total de cellules est limité, la survie cellulaire ne peut être un phénomène passif mais plutôt un processus actif continu où chaque lymphocyte doit rentrer en compétition avec les autres lymphocytes. On peut dire que les lymphocytes suivent la "Red Queen Hypothesis" qui postule que "it takes all the running you can do to keep in the same place".
Cellules T. (Nicolas Legrand en collaboration avec Corinne Tanchot & Benedita Rocha).
Nous avons étudié les conditions nécessaires in vivo à la survie et à l'expansion de cellules T CD8+ naïves et mémoires spécifiques à l'antigène. Pour caractériser les propriétés fonctionnelles et les besoins nécessaires à la persistance des cellules T mémoires, nous avons utilisé des populations T monoclonales. Des souris transgéniques (Tg) portant un TCR Tg ab spécifique de l'antigène mâle HY restreint par la molécule du CMH de classe I H-2Db et déficientes pour le gène de recombinaison RAG2 (TgRAG2-) ont été utilisées pour obtenir des populations monoclonales de cellules T CD8+.
Afin d'étudier les interactions du TCR nécessaires à la survie ou la division de cellules T CD8 naïves, nous avons comparé leur devenir après transfert dans des hôtes irradiés qui différaient pour leur expression de la molécule de Classe I du CMH et de l'antigène HY. Ces hôtes étaient : des males déficients C57BL/6 CD8-/- (HY-H-2b+) et des femelles (HY+H-2b+); des femelles déficientes H-2Db- dénuées de l'élément de restriction de classe I du CMH de ce TgTCR mais exprimant d'autres molécules de classe I du CMH incluant H-2Kb (HY-H-2Db-class I+) et des femelles class I- déficientes à la fois H-2Db et b2-microglobuline (HY-Db-b2m-). Celles-ci ont été utilisées de préférence aux souris déficientes b2m- car ces dernières expriment suffisamment H-2Db pour induire chez la souris mâle la délétion des cellules T Tg spécifiques de l'antigène mâle. Pour corréler la survie cellulaire aux interactions avec l'élément de restriction de classe I du CMH, nous avons aussi utilisé des femelles exprimant H-2Db mais pas H-2Kb (HY-Db+Kb-). Ces hôtes ont été irradiés et injectés deux jours plus tard avec des cellules T naïves. Le rétablissement des cellules Tg a été évalué à jour 1, 2, 7 et 13 après transfert. La division cellulaire T Tg a été étudiée une semaine après transfert en suivant l'incorporation de BrdU.
Un jour après transfert, la fraction de cellules du donneur migrant vers le compartiment des organes lymphoïdes était identiques chez tous les hôtes (environ la moitié de la population cellulaire du donneur). Des cellules T naïves pouvaient survivre au repos chez les femelles déficientes CD8 : elles n'incorporaient pas le BrdU et le nombre récupéré était constant jusqu'à deux semaines après injection. Le développement des cellules naïves a necessité une stimulation par l'antigène mâle puisqu'elles se sont divisées seulement après transfert dans des hôtes mâles déficients CD8. La survie des cellules T nécessitait le bon élément de restriction du CMH. Chez les souris dépourvu H-2Db, ou n'exprimant pas de classe I, les cellules naïves (H2-Db-b2m-) ne survivaient pas ou diminuaient jusqu'à environ 3% par rapport aux cellules injectées à une semaine, 1% à 13 jours et n'étaient plus détectables à 2 semaines. Cet affaiblissement correspondait à l'absence d'interactions avec l'élément de restriction du CMH car les cellules naïves Tg H-2Db persistaient après transfert dans des souris déficientes H-2Kb exprimant H-2Db. Par conséquent, comme cela a été décrit dans la sélection positive du thymus, une activation cellulaire minimale peut permettre la survie en l'absence de division cellulaire.

Plus récemment, nous avons dérivé des lignées de souris double CD3e-/-H-2Db-/- et CD3e-/-H-2Kb-/-. Nous avons aussi dérivé 3 lignées différentes de souris monoclonales Tg TCR : aHYRag2-/-, P14Rag2-/- et OT-1Rag2-/-. Les TCR HY et P14 sont restreints au H-2Db de classe I du CMH. Le récepteur OT-1 est restreint au H-2Kb de classe I du CMH. Nous suivons le devenir des cellules naïves monoclonales T CD8 de ces souris dans des souris non irradiées CD3e-/-H-2Db-/- et CD3e-/-H-2Kb-/- et confirmons que la survie des cellules naïves T CD8 est totalement dépendante de la présence du bon élément de restriction de classe I du CMH. L'utilisation d'hôtes déficients en cellules T exclut formellement toute implication éventuelle des cellules T de l'hôte dans la disparition des cellules T transférées et permet l'utilisation de souris non-irradiées comme receveuses. Toutefois, chez ces hôtes non irradiés déficients en molécule de classe I du CMH et en CD3e, la diminution des cellules naïves T CD8 transférées s'est avérée plus rapide et détectable dès 24 heures après inoculation.
Ensuite, nous avons étudié les interactions TCR nécessaires au maintien des cellules T mémoires CD8+. Pour obtenir des cellules mémoires, des cellules T Tg naïves de femelles ont été stimulées in vivo avec des doses relativement faibles d'antigène mâle dans des chimères male/femelle de moelle osseuse (MO). Nous avons produit des souris male/femelle B en injectant dans des hôtes femelles déficientes Rag-/- un mélange de 90% de cellules de MO femelle et 10% de cellules de MO mâle provenant de souris déficientes CD3e-. Ces hôtes n'avaient pas de cellules T endogènes et 10% des cellules dérivées de MO étaient d'origine mâle. Pour identifier les interactions TCR nécessaires à la survie ou la division des cellules mémoires T CD8 ainsi générées, des populations mémoires purifiées (>97%) (déplétées en cellules B et en autres cellules présentatrices d'antigène de classe II positive) ont été injectées dans des hôtes irradiés qui différaient dans leur présentation d'antigène ou dans l'expression de molécules de classe I du CMH. Le nombre de cellules T transgéniques a été déterminé à jour 1, 2, 7 et 11 après transfert, et la division cellulaire T a été évaluée par incorporation de BrdU à jour 7. 24 heures après transfert, la migration des cellules Tg mémoires était la même chez tous les hôtes et identique à celle des cellules Tg naïves. Lorsque des cellules Tg mémoires ont été stimulées après transfert dans des mâles CD8-, leur taux de division (>90% cellules BrdU+) était plus élevé que celui des cellules naïves. A l'opposé des cellules naïves, les cellules mémoires transférées dans des femelles CD8- se divisaient aussi de façon importante (70% BrdU+), survivaient et se divisaient dans des souris déficientes pour l'expression de l'élément de restriction H-2Db (42% BrdU+). Dans les souris déficients en molécules de classe I (H2-Db-b2m-mice), environ 30% des cellules mémoires incorporaient encore BrdU, indiquant une réponse autocrine ou aux facteurs de croissance de l'environnement, même en l'absence de stimulation T. Cependant, cette réponse était insuffisante pour maintenir les cellules T mémoires et disparaissaient progressivement. Deux semaines après le transfert des cellules T, les cellules du donneur étaient à peine détectables dans des hôtes déficient en molécules de classe I (H2-Db-b2m-).


IV. Sélection lymphocytaire.

Cellules B. (Emmanuelle Gaudin & Manuela Rosado).

Les répertoires lymphoïdes sont formés dans les organes lymphoïdes aux stades précoces du développement B et T par des épisodes de sélection positive et négative. Pour qu'il y ait sélection positive, il suffit qu'un lymphocyte rencontre son antigène spécifique. A l'opposé, une sélection négative totale nécessite que tous les lymphocytes du même clone rencontrent l'antigène. Quel que soit le mécanisme de sélection impliqué, il est évident que la dose d'antigène doit jouer un rôle important dans l'établissement des répertoires B et T. Nous avons étudié les effets de quantités variables d'antigène du Soi dans le développement B. Nous avons étudié un modèle murin dans lequel des cellules B transgéniques spécifiques du lysozyme d'œuf de poule (HEL) se développent en présence de l'antigène du soi HEL. Nous avons utilisé une souris transgénique (Tg) soit pour le BCR anti-HEL (MoMD4), soit une forme soluble d'HEL (ML5), soit pour une forme membranaire d'HEL (KLK3) dans un fond déficient Rag2. Les hôtes non-Tg Rag2-/- ont été irradiés létallement et reconstitués avec un mélange de 50% de cellules de MO et de donneurs MoMD4 aHEL et 50% de cellules de MO de donneurs Rag2-/- et HEL Tg (ML5.Rag2-/- ou KLK3.Rag2-/-) à différents taux. En utilisant des hôtes et donneurs Rag2-/-, nous nous sommes assurés que les seuls lymphocytes présents dans les chimères étaient des cellules B Tg spécifiques pour HEL. En fixant à 50% la part des cellules MoMDR dans les échantillons de MO injectés, nous nous sommes assurés que le taux de production B était identique dans toutes les chimères étudiées. En modifiant les proportions de cellules non-Tg et HEL Tg des 50% restants d'inoculum de MO, nous avons modifié les taux de production d'antigène du Soi. Les précurseurs HEL Tg étant dilués dans des précurseurs non-Tg, la production d'HEL devait varier en fonction de la part de cellules HEL Tg présentes dans l'inoculum de MO d'origine. En effet, nous avons trouvé que c'était le cas. Par Elisa, nous avons quantifié la quantité d'HEL présent dans le sérum des différentes chimères après reconstitution. Nous avons trouvé que les niveaux d'HEL diminuaient avec des nombres décroissants de précurseurs Tg injectés. Six à huit semaines après reconstitution, les chimères ont été sacrifiées et nous avons évalué le nombre et phénotype des cellules de MO pré-B et B, des cellules B de la rate et les niveaux d'IgM sériques.

Nous avons étudié le développement des cellules B MoMD4 spécifiques HEL en l'absence ou en présence de quantités variables d'HEL soluble et membranaire. Chez les hôtes ML5.Rag2-/- reconstitués avec de la MO MoMD4, les nombres de cellules pré-B et B récupérés étaient identiques à ceux obtenus dans les receveurs non-Tg Rag2-/-. Les cellules B mature exprimaient de faibles taux d'IgM de surface, alors que les taux d'IgD restaient inchangés. Les niveaux d'IgM sérique étaient faibles comparés aux souris où les cellules B MoMDR ont été éduquées en l'absence d'HEL. Nous en avons conclu que la présence de concentrations d'environ 20 ng/ml d'HEL soluble induisait des changements fonctionnels des cellules B spécifiques de HEL alors que des taux plus faibles d'HEL n'affectaient pas les cellules B en développement.
Dans les souris KLK3.Rag2-/- reconstituées avec de la MO MoMD4, les cellules B étaient rares et les concentrations sériques d'IgM étaient très faibles. En diminuant la quantité de cellules Tg HELm injectées dans les chimères, nous retrouvions des nombres de cellules B matures et des niveaux d'IgM sérique accrus. Ces résultats démontrent que la sélection négative de cellules B réactives au soi n'est totale que lorsque l'antigène est présent en quantités suffisantes. Des cellules B de forte avidité peuvent persister en présence d'antigène du Soi.

Le BCR Tg utilisé par les cellules B MoMD4 code pour un anticorps anti-lysozyme de grande affinité. Dans un développement normal, les interactions B avec des antigènes du Soi impliquent vraisemblablement des interactions de haute et basse avidité. Récemment, nous avons croisé les lignées MD4 (aHEL) et SP6 (aTNP) Tg et avons obtenu des souris portant deux Tgs IgH et deux IgL dans un fond Rag2-/-. Dans ces souris MoMD4.MoSP6 DigTg, la plupart (>98%) des cellules B se lient à HEL et expriment la chaîne lourde 20.5 SP6 Tg Ig. Le taux d'HEL lié par les cellules B DigTg est réduit à 30% par rapport à celui des cellules B MoMD4 simple BCR, ce qui indique que l'avidité totale de ces cellules pour HEL est inférieure à celles des cellules B MoMD4. Nous avons étudié le développement des cellules B DigTg spécifiques de HEL de faible avidité en l'absence ou en présence de quantités variables d'HEL. Dans des hôtes ML5.Rag2-/- reconstitués avec des cellules de MO provenant de souris DigTg ou dans des chimères injectées avec 50% de cellules de MO de donneurs ML5.Rag2-/-, le nombre de cellules B matures dans la MO et la rate était plus élevé que dans les chimères HEL. L'augmentation du nombre de cellules B était due à l'augmentation des cellules simple transgéniques spécifiques d'HEL. Ces résultats indiquent que de petites concentrations locales d'HEL sont suffisantes pour promouvoir la sélection et la survie de cellules B spécifiques d'HEL. Chez les hôtes KLK3.Rag2-/-, les cellules B double BCR sont délétées malgré leur avidité plus faible pour HEL. En diminuant les quantités d'HEL dans les chimères de MO mélangées KLK3.Rag2-/-, nous récupérons dix fois plus de cellules B que dans les chimères contrôles HEL. Plus de 99% des cellules B étaient des cellules simple transgéniques spécifiques d'HEL. Dans les mêmes chimères, les taux d'IgM avaient aussi augmenté de façon similaire. Dans les souris reconstituées avec moins de cellules MO HELm Tg, les taux de cellules B étaient les mêmes que dans les hôtes HEL, mais les taux d'IgM étaient 20-30 fois plus élevés. Ces résultats montrent que de faibles taux d'antigène du Soi sélectionnent de façon positive des cellules B réactives au Soi de faible avidité. Le fait que les nombres de cellules B soient augmentés aussi bien dans la MO que dans la rate et que le nombre de cellules MO pré-B reste inchangé suggèrent que la sélection positive survient au moment de la transition du stade pré-B au stade B dans la MO. Nous avons établi la première démonstration claire d'une sélection positive des cellules B conventionnelles. De plus, la présence de faibles quantités d'antigènes du Soi induit l'activation de cellules B double récepteur de faible avidité et des taux accrus d'IgMs sériques. La plupart de ces IgMs sont réactifs au Soi et ces souris possèdent une multitude de complexes immuns IgM-HEL. Ces résultats représentent une contribution importante à la compréhension de l'origine de la plupart des Igs réactifs au soi physiologiques : ils suggèrent que ces Igs sont produits lors de l'activation des cellules B réactives au Soi de faible avidité par des antigènes du Soi présents en faibles quantités.

Cellules T. (Nicolas Legrand).

Les récepteurs à l'antigène des lymphocytes B et T sont soumis à l'exclusion allélique. En général, pour les cellules T, les segments de la chaîne TCRb commencent à réarranger sur un chromosome et continuent sur le second chromosome uniquement lorsque la première tentative s'est conclue par un gène non-productif. Toutefois, l'exclusion allélique du TCR n'est jamais infaillible. Différentes études indiquent qu'environ 1% des cellules T ab matures contiennent deux allèles TCRb productifs. De plus, à l'opposé du locus TCRb, des réarrangements de la chaîne TCRa se produisent simultanément dans les deux chromosomes et environ 30% des cellules T ab expriment deux chaînes TCRa. Dans la souris normale, la probabilité d'une production de cellules T avec double spécificité est par conséquent normale. Potentiellement, les cellules T incluses alléliquement pourraient jouer un rôle important dans l'autoimmunité. Dans les cellules double récepteur, un deuxième TCR réactif au Soi pourrait échapper à la sélection thymique négative en raison de sa plus faible expression. Si un antigène du non-Soi stimule les cellules T naïves double récepteur, une fois activées ces cellules T devraient acquérir un seuil inférieur de réponse d'activation au peptide du soi/CMH et entraîner la maladie. Le rôle des cellules T double récepteur dans les maladies autoimmunes est toutefois très lié à leur capacité à être, premièrement sélectionnées positivement, et non négativement, dans le thymus et, deuxièmement à survivre dans les compartiments périphériques. En tenant compte du fait que la sélection thymique positive et la survie des cellules T périphériques nécessitent un engagement du récepteur par les molécules du CMH, il est vraisemblable que la présence de deux récepteurs portant différentes spécificités puisse imposer certaines contraintes pour la sélection, la survie et les capacités fonctionnelles des cellules T double récepteur. Afin d'examiner ces questions, nous avons étudié la sélection T dans le thymus et à la périphérie d'animaux déficients Rag2-/- portant deux transgènes TCR ab réarrangés : un récepteur spécifique de l'antigène male HY (Vb8.2VaT3.70), et un deuxième spécifique du peptide gp33-41 du LCMV (Vb8.2Va2), l'ensemble de ces récepteurs étant restreint par la même molécule de classe I du CMH H-2D.
Dans le thymus de souris MoaHY.MoP14 DTg, le développement T n'engendre que des cellules T CD8 ce qui indique que l'association des différentes chaînes ab des deux TCR Tgs était incapable de produire des cellules T CD4 restreintes par les molécules de classe II du CMH. Le manque de développement T significatif dans des chimères H-2Db-/- de classe I du CMH démontre que toutes les spécificités TCR générées sont restreintes par la molécule H-2Db.
Chez les femelles DTg, ~80% des cellules T CD8 périphériques expriment deux chaînes TCRa mais des cellules simples VaT3.70+ et Va2+ ont également été retrouvées. Plusieurs résultats suggèrent qu'alors que 99% des cellules T CD8 de souris DTg sont Vb8.2+, la plupart des cellules n'expriment pas ou très peu la chaîne Vb8.1 du TCR P14. Premièrement, l'internalisation de la chaîne Vb8.2 du TCR Tg aHY aboutit à une co-internalisation totale de l'ensemble des chaînes Va. Deuxièmement, la stimulation in vitro des cellules T CD8 de souris DTg avec le peptide LCMV gp33-41 n'a pas induit une prolifération cellulaire. Ces souris DTg sont donc un modèle unique d'étude de comportement fonctionnel des cellules T CD8 double TCRa.

L'exposition in vivo de cellules matures DTg de souris femelles à l'antigène male HY, c'est-à-dire après transfert dans des hôtes males, conduit à l'expansion sélective des cellules simples Va2-T3.70+ spécifiques HY et doubles Va2+T3.70+. La réponse immunitaire in vivo des simples Va2-T3.70+ était toutefois plus efficace comme le taux plus rapide d'expansion le montrait. Les cellules simples aHY étaient prédisposées aux effets tolérogéniques d'antigène en excès car 7 jours après transfert dans des receveurs mâles, ces cellules n'étaient plus capables de proliférer après stimulation in vitro et étaient remplacées par des cellules double TCR et des cellules spécifiques non-HY Va2+T3.70-. Le double récepteur exposé in vivo à l'antigène male se développait aussi mais à un taux plus lent et ne disparaissait pas dans les derniers temps après transfert. Elles restaient sensibles à l'induction de la tolérance périphérique. Le fait que les cellules double TCRa prolifèrent peu pour un peptide spécifique mais persistent et ne soient pas remplacées leur permet de continuer à exercer des fonctions régulatrices importantes in vivo.
En utilisant une stratégie compétitive de re-population, nous avons directement eu accès à l'accumulation de cellules T CD8 double et simple récepteur dans les compartiments périphériques de différentes chimères de MO. Lorsqu'elles sont seules, les cellules T de donneurs DTg et simple Tg présentent un fonctionnement identique et génèrent des compartiments périphériques de taille similaire. Quand elles sont mélangées dans le même hôte, les cellules T CD8 exprimant un simple récepteur rentrent en compétition avec les cellules T double récepteur des compartiments périphériques, suivant une hiérarchie où MoP14 > MoaHY * DTg.
Qu'arrive-t-il au développement T en présence de l'antigène du Soi male HY? Dans les males DTg, la présence d'un deuxième TCR Tg réduit l'expression du TCR aHY favorisant l'apparition de nombres significatifs de thymocytes DP et de cellules T TCRhighCD8+ SP. Pendant la transition du stade DP à celui SP, seules les cellules exprimant de plus faibles taux de CD8 et de TCR aHY sont sélectionnées positivement. Nos résultats montrent aussi que, même si la présence d'un second TCR permet le développement et l'émigration de cellules T CD8 matures exprimant un TCR réactif au Soi, ces cellules T double récepteur périphériques sont fonctionnellement tolérantes. Les cellules CD8 double récepteur de mâle, malgré l'expression accrue de la chaîne P14 TCRb, sont incapables de proliférer en raison au peptide LCMV gp33-41 in vitro. Comme les cellules T CD8 de souris males conventionnelles Rag+ aHY Tg et MoaHY, ces cellules T CD8 DTg présentent une expression de surface réduite de CD8 et du TCR spécifique aHY et elles sont insensibles au stimuli de même origine. 80% des cellules MoaHY et environ 40% des cellules double récepteur de souris male expriment le marqueur CD44 d'activation/mémoire et produisent des ARNm codant pour l'INF-g et l'IL-10, suggérant ainsi que ces cellules tolérantes peuvent avoir d'importantes fonctions régulatrices.
Nos résultats indiquent qu'un niveau optimal de signal doit être atteint pour déclencher la survie des cellules T périphériques : de faibles taux de TCR et de CD8 compensent un excès de ligand, une forte expression du TCR le manque de co-récepteurs CD8, etc. Une survie réussie implique par conséquent un processus d'adaptation des populations lymphocytaires à l'environnement de l'hôte. Donc, à l'opposé des males MoaHY où les cellules TCR+CD8- (DN) représentent 60% du compartiment périphérique TCR+, chez la souris male DTg, la plupart des cellules périphériques DN appartiennent à la lignée T gd et, l'expression du récepteur TCR gd pouvant assurer la maturation et la survie des cellules. Nos observations en cours dans des souris Rag2-/- MoaHY démontrent que les cellules TCR+ DN n'ont pas besoin de l'expression des TCRs gd pour survivre. Nos résultats suggèrent que chez le male MoaHY, en présence d'un excès d'antigène du Soi des cellules T périphériques peuvent survivre en l'absence de co-récepteurs CD8 et CD4 si elles expriment des taux plus élevés de TCR. En fait, chez le male DTg, peu de cellules périphériques TCR+ DN présentent des taux plus élevé d'expression aHY TCR.
Dans les souris normales, l'inclusion allélique TCRa survient dans 30% des cellules T ce qui peut représenter un risque immun. Dans la souris DTg, la présence d'un deuxième TCR permet à un nombre significatif de cellules T CD8 double récepteur exprimant un récepteur réactif au Soi d'échapper à la délétion centrale, lors de la sélection négative. Ces cellules non délétées migrent vers les compartiments périphériques mais ne sont totalement capables de répondre au stimuli de même origine. Les cellules double récepteur, qui se développent en l'absence d'antigène du Soi, ont des réponses efficaces après immunisation, restent sensibles à l'induction de la tolérance périphérique mais ne sont pas remplacées après exposition à des niveaux élevés d'antigène du Soi. Elles peuvent donc mettre en avant d'importantes fonctions régulatrices in vivo. Dans l'ensemble, les cellules T CD8 double récepteur ont un faible pouvoir de compétition comparées aux cellules simple TCR et sont contre-sélectionnées dans les compartiments T périphériques. L'ensemble de ces caractéristiques peut contribuer à diminuer le risque autoimmun que les cellules double récepteur pourraient représenter dans des conditions physiologiques normales.



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