Portail IP bandeau_genéral
  Cytotbnk


  Responsable : DI SANTO James (disanto@pasteur.fr)


  resume

 

Le projet proposé vise à mieux définir le rôle des cytokines dans la lymphopoïèse, l'homéostasie lymphoïde périphérique et les réponses immunes, en utilisant une approche génétique développée chez la souris. Une série de projets est en cours, fondée sur une souche originale de souris rendue alymphoïde et développée dans notre laboratoire. Les questions que nous nous proposons d'aborder incluent l'analyse fine du rôle des différentes sous-populations lymphoïdes dans l'immunité innée et la possibilité d'utiliser cette souche alternative de souris immunodéficientes dans les modèles de xénotransplantation des tissus humains normaux ou pathologiques.



  rapport

cale

Unité des Cytokines et Développement Lymphoïde


Activité Antérieure


Nos recherches sont axées sur l'étude du rôle fondamental des cytokines au cours du développement lymphoïde. Notre démarche expérimentale découle de travaux réalisés chez l'homme, concernant le déficit immunitaire combiné sévère lié à l'X ou DICS-X1, au cours duquel la chaîne commune g (gc) des récepteurs de cytokine est affectée. La chaîne gc représente un composant fonctionnel des récepteurs pour les interleukines (IL) -2, -4, -7, -9 et -15, principaux facteurs de développement et de maturation des lymphocytes. L'absence de gc conduit donc à une lymphopoïèse défectueuse chez les patients atteints de DICS-X1, déficit qui se caractérise par l'absence de cellules T et de cellules Natural Killer (NK) périphériques, alors que des cellules B peu fonctionnelles sont présentes. Nous avons créé un modèle murin du DICS-X1 dû à la déficience en gc, en invalidant le gène correspondant par une technique de ciblage de gène modifié. Les souris gc- présentent un développement lymphocytaire anormal, caractérisé par un nombre réduit de cellules ab T et B périphériques et l'absence de cellules lymphoïdes dans la muqueuse digestive de l'intestin. De plus, ces souris sont totalement dépourvues de cellules gd T et NK. Les souris gc, tout comme les patients DICS-X1, sont immunodéficientes et sensibles aux infections, fournissant ainsi un modèle animal important pour l'étude du DICS-X1 et pour l'évaluation des possibilités de thérapie génique de cette maladie. L'analyse approfondie du développement lymphoïde des souris gc- nous a permis de tirer les conclusions suivantes:
- Les cytokines, interagissant avec les récepteurs contenant la chaînegc contrôlent des étapes essentielles du développement des cellules ab T, gd T et NK-T, en induisant des signaux responsables de la prolifération et/ou de la différenciation de ces différents lignages cellulaires selon leur stade de maturation. Les effets similaires du déficit en gc observés dans différents lignages suggèrent l'existence de relations ontogéniques entre ces cellules.
- Le développement intrathymique nécessite des signaux séquentiels se chevauchant et impliquant des récepteurs de cytokines (y compris la chaîne gc) et les récepteurs à l'antigène, qui guident le processus de différenciation des cellules ab T, gd T et T-NK.
- La comparaison des résultats obtenus chez nos sourisgc- avec d'autres lignées de souris dépourvues de cytokines ou de récepteurs faisant partie du réseau gc (souris déficientes en IL-2, IL-4, IL-7, IL-7Ra ou IL-2Rb) indique que les cytokines gc-dépendantes sont individuellement responsables d'un nombre limité d'activités biologiques. Ceci contraste avec la notion prévalente que les cytokines forment un système hautement redondant, et qu'un déficit en une cytokine peut être comblé par une autre. Le modèle que nous favorisons implique que certains effets biologiques peuvent être atteints au travers d'un blocage sélectif de voies mises en jeu par une cytokine dépendante de la chaîne gc.


Projets de Recherche

La production de la lignée de souris gc- s'est révélée importante en permettant des applications nombreuses en recherche appliquée clinique. Comme nous le mentionnons dans le projet proposé ci-dessous, d'autres lignées dérivées des souris gc- ont été produites, qui offrent la possibilité a) d'étudier divers aspects de l'immunité innée, des xénotransplantations et de l'immunologie tumorale et b) de produire des agents thérapeutiques potentiels. Ces nouveaux modèles devraient trouver leur place dans les études d'un certain nombre de pathologies humaines. Les projets décrits ci-dessous ont pour but d'explorer de nouvelles voies en recherche fondamentale, tout en gardant à l'esprit les applications potentielles pour la recherche appliquée clinique.


1.)Rôle des cytokines dans la différenciation des cellules T (J. Di Santo)

Nos études précédentes ont montré que le pré-TCR représente un signal indépendant de la présence de la chaîne gc, essentiel pour le développement des cellules ab T. Cependant, cette observation ne permet pas d'expliquer à elle seule par quel(s) mécanisme(s) les cellules ab T peuvent se développer, être exportées du thymus et survivre en périphérie. Au cours de la sélection intrathymique, les TCRs autoréactifs sont éliminés afin de maintenir la tolérance au soi. La présence de cellules T déréglées et activées en périphérie chez les souris gc- suggère que ce processus de sélection négative pourrait être défectueux. A l'inverse, le processus d'activation des cellules T en périphérie chez les mêmes animaux pourrait refléter un phénomène d'anergie. Afin d'analyser le rôle des signaux dépendants de la chaîne gc dans la différentiation T périphérique, nous avons entrepris de réaliser les études suivantes:

Sélection intrathymique et rôle des cytokines-gc dans la tolérance au soiNous avons précédemment étudié la sélection du transgène TCR spécifique de l'antigène mâle (HY) restreint par les antigènes du CMH de classe I. Cependant, il est possible que les processus de sélection existant chez les souris gc non transgéniques soient différents, puisque la majorité de leurs cellules ab T périphériques sont CD4+.
Afin d'étudier cette possibilité, nous avons analysé en collaboration avec le Dr. O. Lantz (INSERM U25, Paris), une nouvelle lignée transgénique sélectionnée par les molécules du CMH de classe II et spécifiques de l'antigène mâle (CD4-HY). Les résultats préliminaires indiquent que les sélections négatives et positives de ce TCR ne sont pas non plus affectées en l'absence de gc. Ces données suggèrent que les défauts de sélection intrathymique ne sont pas impliqués dans la présence de cellules T CD4+ "déréglées" chez les souris gc-. Elles suggèrent également que l'activité des cytokines gc au cours du développement intrathymique pourrait être restreint aux cellules précurseurs thymiques les plus précoces.

Homéostasie des cellules ab T en périphérie: comparaison du rôle des cytokines et du TCR
)Des études antérieures ont identifié la "sélection positive périphérique" par les molécules du CMH comme un mécanisme important pour le maintien des cellules ab T en périphérie, ainsi que pour l'homéostasie des cellules B. La survie en périphérie des cellules T requiert l'engagement continu du CMH. Cependant, ces résultats n'ont pas permis d'exclure la contribution des cytokines produites de façon endogène, et le rôle des cytokines dans l'homéostasie des cellules T n'est pas entièrement éclairci.
Nous avons analysé le développement de cellules T périphériques à partir de souris femelles RAG2-déficientes et transgéniques pour le TCR (CD4-HY, cellules naïves) portant ou non la mutation gc. Nous avons observé que la chaîne gc était requise pour la survie des cellules ab T CD4+ naïves, même en la présence des molécules du CMH. Ce résultat démontre que les cytokines dépendantes de la chaîne gc jouent un rôle essentiel dans l'homéostasie des cellules naïves. Afin d'identifier la nature des cytokines dépendantes de la chaîne gc impliquées dans ce processus, des cellules T monoclonales gc+ transgéniques seront transférées dans des femelles hôtes déficientes pour diverses cytokines (souris invalidées pour les gènes de l' IL-2, IL-4, IL-7, IL-15).
Les cytokines dépendantes de la chaîne gc ont longtemps été considérées commes les facteurs de croissances primordiaux des lymphocytes (l'IL-2 fut identifié comme " T cell growth factor "). Cependant, le rôle définitif des cytokines gc dans la prolifération induite par l'antigène in vivo demeure à être mis en évidence. Nous avons récemment évalué si les cytokines étaient requises pour les réponses antigéniques en utilisant notre système de transgène du TCR. De façon surprenante, nos résultats montrent que les cellules T CD4+ gc- sont capables de proliférer de manière antigène-spécifique aussi bien que les cellules normales contrôles gc+. Ces résultats mettent en question le rôle physiologique des cytokines gc au cours des réponses immunes périphériques in vivo. Il est intéressant de constater que les cytokines gc semblent essentielles à la fois dans le thymus et dans la périphérie à des stades précédant l'engagement du récepteur pour l'antigène.
Sur la base de ces résultats, il semble que les cytokines gc pourraient représenter des agents thérapeutiques prometteurs pour augmenter le nombre des précurseurs thymiques précoces et pour maintenir le pool de cellules T naïves in vivo : des combinaisons appropriées de cytokines gc pourraient être utilisées dans les cas de déficits immunitaires, de manifestations autoimmunes, ou pour augmenter les réponses immunes lors des vaccinations.

Les cytokines-gc et l'homéostasie périphérique des cellules gd T, NK-T et NK
Les signaux responsables du maintien des cellules impliquées dans la réponse immunitaire innée demeurent inconnus. Nous avons émis l'hypothèse que les cellules gd T, NK-T et NK jouent un rôle majeur dans la réponse immune innée et sont majoritairement maintenues à la périphérie par l'intermédiaire de cytokines. Afin d'étudier cette hypothèse plus avant, nous nous proposons de réaliser une série d'expériences de transfert. Des populations de cellules monoclonales seront isolées à partir de différentes souris : cellules gd T provenant de souris déficientes pour le gène RAG2 et transgéniques pour le TCRgd (en collaboration avec le Dr. P. Pereira, Institut Pasteur), cellules NK-T provenant de souris TCRa-/- transgéniques pour Va14 (en collaboration avec le Dr. O. Lantz, INSERM U25), et cellules NK à partir de souris RAG2-/-. Ces cellules seront transférées chez une nouvelle lignée alymphoïde (voir ci-dessous), et chez diverses souris hôtes déficientes pour des cytokines dépendantes de gc ou dans des souris hôtes déficientes en ligand (souris CD1-/- pour les cellules NK-T). Ces études devraient permettre une évaluation du rôle des cytokines dans la survie des différentes sous-populations lymphoides en périphérie et constitueront la base des projets ultérieurs impliquant la reconstitution immunitaire (voir plus loin).


2.)Développement des cellules NK: analyse in vivo (F. Colucci, C. Roth)

Il n'existe que quelques souches de souris rendues génétiquement alymphoïdes (ç.à.d. dépourvues de cellules T, B, et NK) et offrant la possibilité d'analyser et de reconstituer le système immunitaire de façon contrôlée. L'utilisation de ces souris est généralement limitée par leur longévité diminuée ou leur infertilité.
Nous avons créé une nouvelle souche alymphoïde en tirant parti du fait que les souris gc- ont un déficit complet en cellules NK. En effet, en croisant cette souche avec des souris RAG2-/-, nous avons créé une lignée dépourvue de toute cellule mature T, B, et NK ainsi que de leurs précurseurs (RAG2-/-/ gc-). Ces souris sont viables, fertiles et ont une longévité normale dans des conditions SPF. Elles peuvent être greffées sans irradiation préalable et ne présentent pas de formation spontanée de tumeurs. Cette nouvelle souche constitue ainsi un modèle murin unique.
La souche de souris RAG2-/-/ gc- a été utilisée dans des études de complémentation visant à analyser, au niveau moléculaire, les conditions nécessaires au développement des cellules NK ainsi que des cellules des lignées B et T. Afin de valider notre approche expérimentale, nous avons produit des chimères lymphoïdes en injectant des progéniteurs hématopoïétiques provenant de foie foetal sauvage ou mutant délété du proto-oncongène c-abl (en collaboration avec Dr. V. Tubylewicz, Londres) chez les souris RAG2-/-/ gc-. Dans les deux cas, nous avons pu mettre en évidence une reconstitution à long terme en cellules T, B et NK fonctionnelles in vivo (démontrées par les réponses Ig spécifiques d'antigène, le rejet de tumeurs) et in vitro (tests de prolifération, de cytotoxicité NK). Ce nouveau système de complémentation devrait permettre d'aborder les bases génétiques de la différenciation des cellules NK in vivo.
Nous avons alors entrepris de déterminer si l'absence de certaines molécules de signalisation intracellulaires impliquées dans le développement des cellules T ou B perturbe également la différenciation des cellules NK. Selon des résultats antérieurs, la tyrosine kinase syk joue un rôle crucial dans le développement des cellules B, en transmettant des signaux à partir du récepteur BCR. Syk a également été indirectement impliqué dans le développement des cellules NK (signalisation par les récepteurs Fc et l'IL-2 ou l'IL-15). Cependant, en utilisant les cellules foetales syk-/- (en collaboration avec le Dr. V. Tubylewicz et le Dr. M. Turner, Londres), nous avons pu démontrer que syk n'est pas indispensable au développement NK et à l'activité NK normale. Des études similaires utilisant des cellules de foie foetal et/ou des cellules ES mutantes pour c-kit, PU.1, et vav-1 sont en cours (les cellules seront obtenues dans le cadre de collaborations avec divers laboratoires). En exploitant ce système unique de complémentation NK, nous espérons pouvoir obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires requis pour la différenciation des cellules NK in vivo.
En outre, un système de différenciation des cellules NK in vitro a été établi au laboratoire à partir de précurseurs hématopoïétiques. Ce système produit des cellules exprimant les récepteurs inhibiteurs Ly49. Ces expériences démontrent que l'acquisition de Ly49 est un processus séquentiel qui dépend des interactions avec les molécules du CMH. Nos études futures, utilisant les souris RAG2-/-/ g
c- exprimant différents allèles du CMH, nous permettront de déterminer si ce processus procède de façon similaire in vivo.
En collaboration avec Dr. B.A. Croy (Ontario, CA), les souris RAG2-/-/ g
c- ont été utilisées pour étudier le rôle des cellules NK utérines. La fonction de ces cellules associées à la gestation demeure mal définie, et divers auteurs leur ont attribué un rôle dans l'interface foeto-maternelle. Nous avons observé que les souris RAG2-/-/ g
c- ont des capacités de reproduction normales (avec des portées de taille normale), ce qui exclut un rôle essentiel des cellules NK utérines dans le développement fœtal. A l'inverse, le développement placentaire normal et plus particulièrement le développement vasculaire utérin semble requérir la sécrétion d'IFN-g par les cellules NK utérines. Ces observations suggèrent que les déficits dans la fonction de ces cellules pourraient être impliquées dans les syndromes présentant une placentation anormale ou la prééclampsie.


3. Rôle de différentes sous-populations lymphoïdes dans les réponses immunitaires contre les agents pathogènes (J. Di Santo)


Le rôle des cellules NK dans la réponse contre les agents pathogènes peut être testé chez les souris gc-. En utilisant le modèle bien établi de la listériose murine (en collaboration avec le Pr. F. Brombacher, Le Cap, Afrique du Sud), nous avons récemment pu démontrer que l'immunité innée contre L. monocytogenes peut se développer en l'absence de cellules NK. Ces résultats démontrent d'une part que les cellules ab T peuvent, dans certaines conditions, remplacer les cellules NK et soulignent d'autre part les interactions potentielles entre les réponses innées et adaptatives contre les agents pathogènes. A l'inverse, les souris RAG2-/-/ g
c- succombent rapidement à l'infection par L. monocytogenes par voie intraveneuse, ce qui démontre que les cellules hématopoïétiques d'origine non lymphoïde ne sont pas capables à elles seules de combattre ce type d'infection. Alors que la sécrétion de cytokines (comme l'IFN-g) par les cellules NK a été impliquée comme l'un des principaux activateurs des mécanismes effecteurs de la réponse innée, d'autres sous-populations de cellules T sont également capables d'un relargage rapide de cytokines à la suite de l'activation du TCR (NK-T, gd T). Nous proposons d'examiner les rôles joués par les cellules ab T, gd T, NK-T et NK au cours de réponses innées, en utilisant le modèle de la listériose murine. Nous analyserons la capacité des souris RAG2-/-/ g
c- reconstituées de manière sélective (après transfert de populations purifiées) à combattre une infection orale de L. monocytogenes. Ces études devraient nous permettre de mieux comprendre le rôle et la participation de populations lymphoïdes individuelles dans la réponse innée.
Les cellules immunitaires associées au tube digestif participent à l'élimination des cellules épithéliales endommagées ou infectées et contribuent ainsi à maintenir l'intégrité de cette surface muqueuse. L'absence complète de lymphocytes intraépithéliaux et des plaques de Peyer chez les souris gc- offre un moyen d'analyser les fonctions potentielles des différentes sous-populations de lymphocytes intra-épithéliaux dans l'immunité du système intestinal.
En utilisant le modèle d'infection par Shigella par voie respiratoire (en collaboration avec le Pr. P. Sansonetti, Institut Pasteur), nous proposons de comparer la capacité des souris RAG2-/-/ g
c- et RAG2-/-/ g
c- reconstituées par les diverses sous-populations, à combattre ces différents agents infectieux.


4. Utilisation des souris gc- dans les études ex vivo chez l'homme T (J. Di Santo)

L'absence de cellules NK fonctionnelles chez les souris gc- distingue cette lignée de souris de la plupart des modèles de rongeurs immunodéficients, tels que les souris SCID, nu/nu ou RAG-/-, qui possèdent toutes des cellules NK. Bien que le rôle de ces cellules in vivo demeure mal défini, elles semblent capables de médier une résistance naturelle contre certaines tumeurs et ont été impliquées dans le rejet de greffes xénogènes chez la souris. L'incapacité des souris gc- de médier cette "cytotoxicité naturelle" pourrait offrir un avantage significatif par rapport à l'utilisation des souris SCID, nu/nu ou RAG-/- pour la transplantation de tissus humains. En collaboration avec différentes équipes extérieures, les souris RAG2-/-/ g
c- on été évaluées comme alternatives à ces autres lignées afin de permettre les études nécessitant des tissus humains ou des greffes de tumeurs.

En collaboration avec l'équipe du Dr. J. Goldman (Institute for Child Health, Londres), une série de résultats a été obtenue en utilisant les souris RAG2-/-/ gc- dans des greffes de cellules humaines. La souche de souris RAG2-/-/ gc- a été comparée à la souche NOD/SCID (qui représente le modèle le plus utilisé à l'heure actuelle). Des lymphomes B ainsi que des lymphocytes du sang périphérique normaux humains ont pu être greffés avec succès chez les souris mutantes RAG2-/-/ gc-. En outre, les souris RAG2-/-/ gc- ont pu être greffées sans conditionnement préalable (irradiation) et aucune formation spontanée de tumeur n'a été observée (ce qui représente un net avantage comparé au modèle de souris NOD/SCID ).
En utilisant les souris RAG2-/-/ g c- mice comme point de départ, nous sommes en train de produire une série de nouvelles souches de souris immunodéficientes avec des défauts additionnels dans les voies de défense naturelle. Par exemple, nous avons déjà incorporé une mutation affectant le composant C5 du complément sur le fond génétique RAG2-/-/ g c- (souris RAG2-/-/ g c-/C5). De manière semblable, nous produisons actuellement les souris RAG2-/-/ g c-/NOD mice. Ces souches dérivées de RAG2-/-/ g c- pourraient fournir un potentiel supplémentaire de greffes pour certains types de tissus. Nous examinons à l'heure actuelle l'utilité des souris RAG2-/-/ g c- et de leurs dérivés pour la transplantation de tumeurs humaines et de tissu musculaire. Ces différents travaux sont réalisés en collaboration avec plusieurs équipes parmi lesquelles celles du Dr. P. Auguste, Bordeaux (transplantation de gliomes), du Dr. G. Butler-Brown, Paris et du Dr. T. Partridge, Londres (transplantation de muscle), qui ont déjà établi ces modèles d'étude.
Les résultats préliminaires suggèrent que les transplantations de muscle humain peuvent être réalisées avec succès dans les souris RAG2-/-/ g c-, contrairement à ce qui a été observé avec les autres modèles de souris immunnodéficientes testés jusqu'à présent. Ce résultat très important dans le domaine de la xénotransplantation devrait faciliter les études ultérieures sur le transfert de gènes dans les myodystrophies humaines. D'autre part, l'utilisation des souris NK-déficientes RAG2-/-/ g c- pourrait permettre le développement de tumeurs humaines in vivo précédemment impossibles à établir chez l'animal. Cette stratégie pourrait alors permettre l'évaluation de nouvelles thérapies pour les cancers et les pathologies humaines.


Perspectives)

Nous pensons que l'ensemble des projets proposés pourrait améliorer notre compréhension du développement lymphoïde, de la réponse innée et adaptative, et fournir de nouveaux modèles permettant l'étude des processus pathologiques connus chez l'homme. Ces projets sont de nature fondamentale, mais ont d'importantes implications en médecine clinique.



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Mme PHAM Cécile, Institut Pasteur

COLUCCI Francesco, Institut Pasteur

DI SANTO James, INSERM

ROTH Claude, Institut Pasteur

BREGENHOLT Soren, Stagiaire post-doc

CARAUX Anouk, Stagiaire DEA

RANSON Thomas, Stagiaire DEA

ROSMARAKI Eleftheria, Etudiante en thès

SAMSON Sandrine, Etudiante en thèse

VOSSHENRICH Christian, Stagiaire post-doc

CORCUFF Erwan, technicien Institut Pasteur

RICHARD Odile, technicienne Institut Pasteur


filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr.