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  Responsable : Huynh Dinh Tam (hdt@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de l'Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l'étude de trois classes importantes de composés biologiques : nucléosides ou nucléotides, peptides et sucres. L'accès à ces molécules permet de déterminer leurs structures et leurs interactions, en vue de la mise au point de vaccins synthétiques ou d'inhibiteurs d'enzymes, en collaboration avec d'autres unités pasteuriennes. Deux groupes de l'Unité on développé un programme de sélection in vivo et d'évolution dirigée in vitro d'enzymes.



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Polyosides bactériens et développement de vaccins chimiquement définis. Synthèse et caractérisation d'"épitopes osidiques protecteurs" : une approche indispensable (L. Mulard)

La nécessité d'un vaccin contre l'infection par Shigella flexneri serotype 2a, une bactérie à Gram négatif responsable de la forme endémique de la dysenterie bacillaire, est l'une des priorités de l'OMS dans le cadre du développement de vaccins entériques. La protection contre l'infection est essentiellement médiée par une réponse dirigée contre la partie antigène O (Ag-O) du lipopolysaccharide (LPS). La notion d'"épitopes protecteurs" a pu être définie et l'hypothèse a été émise que de tels épitopes pourraient être utilisés dans la conception de vaccins chimiquement définis. La caractérisation de ces épitopes protecteurs est en cours au laboratoire pour les LPS des bactéries Shigella flexneri sérotype 5a (modèle) et Shigella flexneri sérotype 2a, dont les unités répétitives sont deux pentasaccharides ramifiés régioisomères. Les fragments di-, tri-, tétra- et pentasaccharides, obtenus par permutation circulaire des résidus composant l'unité répétitive, requis en série S. flexneri sérotype 5a ont été synthétisés par voie chimique et caractérisés par analyse conformationnelle en solution. En série S. flexneri sérotype 2a, la quasi totalité des fragments correspondants ont également été synthétisés. L'affinité des oligosides synthétisés pour différents anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des deux sérotypes a été évaluée par ELISA d'inhibition. En série 5a, la reconnaissance par les IgAs sécrétoires correspond à des IC50 faibles (20 mM pour les pentasaccharides). En série 5a comme en série 2a, les études de la reconnaissance par les IgGs protectrices indiquent une meilleure affinité (IC50 de l'ordre de 1 à 100 µM pour les pentasaccharides). La ramification apparaît comme l'élément clé de la reconnaissance. Pour ces systèmes, l'étude structurale des complexes anticorps:oligoside est envisageable. Les résultats obtenus ont permis de concevoir une stratégie de construction de glycoconjugués à potentiel vaccinal contre S. flexneri sérotype 2a. Leur synthèse est en cours.


Présentation d'antigènes peptidiques (F. Baleux)

Dans le but de mettre au point un vaccin synthétique contre la Shigellose, des résultats préliminaires d'immunisation avec des peptides mimant l'antigène O du LPS couplés au système MAP (Multiple Antigen Peptide) ou à la BSA montrent qu'il est possible d'obtenir des anticorps qui reconnaissent le LPS de Shigella flexeneri.
La présentation via le système MAP d'antigènes peptidiques nous a permis d'identifier un nouvel épitope B de la Pf72/HSP70-1 de Plasmodium falciparum, épitope non détecté avec le peptide monomérique linéaire, suggérant que la stratégie MAP est aussi particulièrement adaptée pour la détection d'épitopes conformationnels.


Epitopes glycosylés secrétés par Mycobacterium tuberculosis (L. Mulard, F. Baleux)

Des données récentes indiquent le rôle clé de protéines mannosylées sécrétées en tant qu'antigènes immunodominants lors de l'infection par M. tuberculosis. L'existence d'épitopes dominants de type glycopeptides a été suggérée. La séquence en amino acides des cibles potentielles est connue, cependant l'approche biochimique n'a pas permis de révéler leur véritable glycoforme. Bénéficiant de la flexibilité de la synthèse chimique, tant celle des oligosides que celle des peptides, nous avons entrepris de caractériser les glycoformes critiques pour l'immunogénicité. Ainsi, la synthèse d'une panoplie de peptides diversement glycosylés est en cours. Dans un premier temps, les acide aminés glycosylés requis ont été synthétisés sous une forme appropriée à leur incorporation dans les séquences peptidiques cibles.


Glycopeptides synthétiques à potentiel vaccinal anti-tumoral (S. Bay)

S'appuyant sur une approche rationnelle et spécifique de l'immunothérapie anti-tumorale, notre programme de recherche vise à développer des vaccins synthétiques basés sur des marqueurs tumoraux saccharidiques. Nous avons ainsi mis au point un nouveau type d'immunogène : le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide qui présente l'épitope saccharidique d'intérêt (i.e. le marqueur tumoral) de façon multivalente en association avec un épitope T CD4+ peptidique. Le caractère synthétique des MAG constitue un avantage de sécurité essentiel en vue de leur utilisation in vivo.
L'ensemble de nos résultats (collaboration avec R. Lo-Man et C. Leclerc) montre que le MAG est une stratégie efficace pour générer des taux élevés d'anticorps spécifiques du marqueur saccharidique et prolonger la survie de souris porteuses de tumeur, après vaccination thérapeutique ou prophylactique.
Notre objectif est désormais de synthétiser une nouvelle génération de composés plus efficaces et utilisables chez l'homme, en introduisant des épitopes T CD4+ "universels" ainsi que des épitopes CTL humains au sein des structures. L'immunogénicité de premiers composés modèles linéaires est en cours d'évaluation chez des souris transgéniques pour les molécules HLA. Les glycopeptides sélectionnés seront ensuite assemblés sous forme de MAG par couplage de fragments.
Une autre partie de notre programme consiste à synthétiser des glycopeptides pour induire des réponses T cytotoxiques spécifiques, ainsi que pour étudier la spécificité de glycosyl transférases, d'anticorps, et de lectines.


Chimiokines/VIH (F. Baleux)

L'intérêt suscité par la découverte des co-récepteurs d'entrée du VIH (principalement CCR5 et CXCR4), a été renforcé par l'observation que leurs ligands naturels, les chimiokines, inhibent des étapes précoces du cycle réplicatif. Les CC chimiokines RANTES, MIP-1a et MIP-1ß, qui sont des agonistes de CCR5, inhibent l'entrée de souches R5 isolées dans les premiers stades de l'infection. La CXC chimiokine SDF-1, unique ligand de CXCR4, inhibe la fusion cellulaire et l'infection par des souches X4 isolées à un stade plus avancé de la maladie.
De plus, les propriétés biologiques des chimiokines semblent être modulées par leurs associations avec les protéoglycans. Nous avions identifié une séquence d'acides aminés basiques dans SDF responsable de la fixation aux héparans sulfates. Nous avons démontré qu'une seule mutation suffit pour diminuer fortement cette interaction. Le complexe SDF/HS a été modélisé.
Les chimiokines sont des protéines de 70 acides aminés, de taille accessible à la synthèse chimique qui permet d'obtenir assez rapidement des quantités importantes de protéines (10-50 mg) de grande pureté. Elle permet surtout le marquage sélectif de ces protéines avec des fluorochromes ou de la biotine ainsi que l'insertion d'acides aminés non naturels. Ces protéines, judicieusement modifiées, conservent toutes leurs activités biologiques. Dans le cas de SDF, la Lys N-terminale ayant un rôle primordial pour son activité biologique, un marquage de la protéine avec les techniques classiques conduirait à une molécule non fonctionnelle. En utilisant nos mutants dépourvus d'affinité pour les héparans sulfates dans un test de fusion cellulaire et le transfert de fluorescence entre SDF marqué en C-terminal par du TexasRed et un GFP-CXCR4, nous avons démontré que l'interaction entre SDF et les héparans sulfates de la surface cellulaire était nécessaire pour une inhibition optimale de l'infection par des virus X4.
Dans le but de cocristalliser les complexes SDF/CXCR4 et MIP1b/CCR5, les 2 chimiokines synthétiques biotinylées en C-terminal sont utilisées dans les étapes de purification des récepteurs correctement repliés.
Nous étudions également la régulation protéolytique de SDF et de son récepteur.


Synthèse et réactivité biologique de nucléosides hétérodoxes (A. Kaminski, S. Pochet)

Notre activité de recherche vise à élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliquées in vitro ou in vivo. Ainsi, nous avons développé un procédé combinatoire de synthèse permettant d'engendrer une vaste collection de nucléosides triphosphates pour les soumettre à des tests d'incorporation par des ADN polymérases et cribler des monomères doués de capacité d'appariement univoque ou ambiguë et/ou des inhibiteurs de réplication. Parallèlement à l'altération de la partie hétérocyclique du nucléoside, une deuxième modification concernant le squelette phosphopentose a été abordée. Nous avons montré que des mimes d'acides nucléiques où l'ose est constitué d'un cycle à six atomes (Hexitol Nucleic Acid) sont reconnus par les ADN polymérases et peuvent transférer l'information génétique in vivo. Afin d'accéder à une plus grande diversité d'analogues nucléosidiques déviant par la base ou par le sucre, nous sélectionnons in vivo des variants des nucléosides phosphorylases et N-désoxyribosyltransférase. Par ailleurs, un programme visant à proposer des molécules inhibitrices d'enzymes essentielles à la croissance de M. tuberculosis vient de débuter.


Synthèse d'analogues de nucléosides et nucléotides comme antiviraux potentiels (L. Mulard)

Notre principal objectif est de concevoir de nouveaux antiviraux en nous appuyant sur une étude approfondie de deux étapes clés de la réplication antivirale. Ainsi, des données récentes ont montré que les nucléosidesa-boranophosphate étaient de bons candidats pour le développement d'antiviraux actifs contre les souches résistantes de HIV. Nous avons entrepris, sur le modèle d4T, de synthétiser différents modèles de pro-drogues susceptibles de pallier au problème du passage transmembranaire de ces analogues chargés. Avec pour finalité le développement de nouveaux antiviraux ciblant le virus de la Dengue, plusieurs analogues de Ribavirine, spécifiquement modifiés en position 2 et 3 du ribose, ont été synthétisés.


Oligonucléotides (T. Huynh-Dinh)

L'étude structurale des acides nucléiques par spectroscopie IR, Raman, CD et RMN a été poursuivie sur la formation de triples hélices GT parallèle et anti parallèle ainsi que sur les interactions boucle-boucle d'ARN génomique HIV-Lai favorisées ou non par la nucléocapside NCp7. Dans le cadre de l'étude du pontage interbrin du trans-diamino dichloroplatine, nous avons testé différentes méthodes de ligation enzymatique et chimique (en solution et sur support solide) en vue de l'obtention de grandes quantités d'oligodésoxynucléotides circulaires.
Dans le domaine des puces à ADN, nous collaborons avec différents laboratoires sur la mise au point des méthodes de greffage covalent en 3' et en 5' d'oligonucléotides présynthétisés sur un support lame de verre silanisé (amine ou hydrazine).


Evolution dirigée d'enzymes (JL Jestin)

Dans le groupe d'évolution dirigée des enzymes, nous développons une chimie des Inovirus pour sélectionner des protéines en fonction de leur activité catalytique. L'objectif consiste à élaborer une stratégie qui permette d'isoler des catalyseurs pour des réactions chimiques données par sélection in vitro.
La sélection in vitro en fonction de l'activité catalytique est une sélection en fonction de l'affinité pour le produit, qui est ponté à la phage-enzyme qui a catalysé la réaction de substrat à produit. Les enzymes sont exprimées à la surface de phages pour établir un lien entre le génotype, qui est amplifiable et qui caractérise la protéine, et le phénotype, c'est-à-dire l'activité catalytique recherchée.
Ainsi, il a été montré que des ADN-polymérases ADN-dépendantes peuvent être exprimées comme des enzymes actives à la surface de bactériophages filamenteux. Ces protéines de plus de 65 kDa sont faiblement exprimées à la surface des phages, 1 phage-polymérase pour 1000 phages, lorsque le système du phagemide est utilisé. Nous avons montré qu'un taux d'expression de 1 pour 5 pouvait être atteint en isolant des séquences signal à partir d'une banque de séquences signal bien choisie soumise à plusieurs cycles de sélection in vitro. Un consensus pour les séquences signal qui optimisent l'expression de ces protéines à la surface de phages a été défini.
Actuellement, nous visons à développer de nouvelles sélections en fonction de l'activité catalytique pour d'autres enzymes et à isoler des catalyseurs pour des réactions choisies à partir de banques de protéines synthétiques ou naturelles.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Garnier Marie-Ange

Baleux Françoise, CR IP

Bay Sylvie, Assistante IP

Huynh-Dinh Tam, DR1 CNRS

Jestin Jean-Luc, Assistant IP

Kaminski Pierre-Alexandre, CR IP

Mulard Laurence, CR IP

Pochet Sylvie, CR1 CNRS

Vichier-Guerre Sophie, CR2 CNRS

Bélot Frédéric, Post-doc

Cadena Amaro Claudio, Thèse

Perrier Sandrine, Thèse

Wright Karen, Post-Doc

Coïc Yves-Marie

Delafond Nathalie

Dugué Laurence

Fantini Emmanuelle

Gouyette Catherine

Groh François

Guerreiro Catherine

Helynck Olivier

Huteau Valérie

Raghouber Josiane

Ughetto-Monfrin Joël

Vieira Da Silva Francisco


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