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  Responsable : Alzari, Pedro M. (alzari@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de recherche de l'Unité de Biochimie Structurale sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes centraux de recherche comprennent l'enzymologie structurale de microorganismes pathogènes (mycobactéries, trypanosomatides) et la reconnaissance moléculaire de sucres dans différents systèmes biologiques.



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Le cellulosome bactérien, reconnaissance moléculaire de sucres (B. G. Guimaraes, F. Schaeffer, H. Souchon, D. Tello, P.M. Alzari)

La bactérie thermophile anaérobie C. thermocellum synthétise un système enzymatique, le cellulosome, capable de dégrader la cellulose cristalline. Le cellulosome est composé de plusieurs sous-unités catalytiques (glycosidases) et non-catalytiques associées sous la forme d'un complexe muliti-protéique de haut poids moléculaire. En collaboration avec P. Béguin (IP), nous avons entamé depuis plusieurs années l'analyse structurale et fonctionnelle des sous-unités du complexe afin de comprendre les bases moléculaires de l'hydrolyse de polysaccharides et la spécificité des interactions protéine-protéine et protéine-sucre. Parmi nos travaux récents, nous avons réalisé une étude structurale et thermodynamique des interactions cohésine-dockérine (responsables de l'assemblage macromoléculaire du cellulosome) et nous avons déterminé la structure tridimensionnelle de la principale composante enzymatique du complexe, la cellobiohydrolase CelS, à 2.2 Å de résolution.L'étude cristallographique à résolution atomique de l'endoglucanase CelA complexée au substrat saccharidique nous a permis de définir le mécanisme catalytique de l'enzyme, dans lequel la distorsion de l'oligosaccharide lié au site actif jouerait un rôle stabilisateur de l'état de transition réactionnel, et d'analyser le rôle précis des molécules d'eau dans l'affinité et la spécificité des interactions protéine-carbohydrate. Autres complexes protéine-sucre d'intérêt biomédical ont été récemment étudiés par diffraction des rayons-X au laboratoire, incluant la reconnaissance moléculaire de l'antigène Tn par des anticorps et des lectines spécifiques (en collaboration avec E. Osinaga, Fac. de Médicine, Uruguay) et la reconnaissance immunitaire du lipopolysaccharide de V. cholerae (en collaboration avec J.M. Fournier, IP, et P. Kovac, NIH, USA).


Trans-sialidases de trypanosomes (M.F. Amaya, A. Buschiazzo, P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei, l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec l'équipe de A.C. Frasch (Université de San Martin, Argentine), nous avons entamé l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques.


Enzymes mycobactériennes impliquées dans la résistance aux antibiotiques et dans la signalisation cellulaire (B. Boitel, B.G. Guimaraes, M. Ortiz, T. Nguyen, H. Souchon, P.M. Alzari)

En s'appuyant sur les résultats génomiques, nos études visent à élucider la structure tridimensionnelle d'enzymes mycobactériennes étant (ou pouvant être) associées à la pathogénicité et à la virulence de M. tuberculosis, afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques. En collaboration avec les équipes de S.T. Cole et O. Barzu (IP), nos travaux portent sur deux enzymes impliquées dans les mécanismes de résistance aux antibiotiques (la catalase-peroxidase KatG et l'alkyl hydroperoxide réductase AhpC) et sur la famille de Sérine/Thréonine protéines kinases et protéines phosphatases impliquées dans la signalisation intracellulaire. Au cours de la dernière année, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle d'AhpC à 2.2 Å de résolution, dont l'affinement cristallographique est en cours. Par ailleurs, l'ensemble de gènes codant pour les domaines catalytiques des protéines kinases et phosphatases dans le génome de M. tuberculosis ont été sous-clonés dans des vecteurs d'expression bactériens appropriés et, pour certains, les protéines recombinantes ont été obtenues sous forme soluble. La caractérisation biochimique et structurale des différentes protéines est en cours.


Le facteur inducteur d'apoptose AIF, représentant d'une nouvelle famille de flavoprotéines (M.J. Mate Perez, M. Ortiz, B. Boitel, D. Tello, P.M. Alzari)

La mitochondrie joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose ou mort cellulaire programmée. Les facteurs mitochondriaux impliqués dans ce processus incluent le cytochrome c, certaines procaspases et le facteur inducteur d'apoptose AIF. En collaboration avec l'équipe de G. Kroemer à Villejuif, ce dernier a été identifié comme étant une flavoprotéine homologue à une famille d'oxydoréductases bactériennes. La protéine AIF recombinante est capable d'induire la condensation de chromatine dans des noyaux isolés et la fragmentation à grande échelle de l'ADN, ainsi que la libération des protéines apoptogéniques à partir des mitochondries purifiées. L'objectif central de notre étude est de caractériser structuralement le facteur murin inducteur d'apoptose AIF et des enzymes mycobactériennes homologues, afin de comprendre les mécanismes catalytiques de cette nouvelle famille d'oxydoréductases et leur rôle dans l'initiation et la régulation de l'apoptose.


Etude cristallographique de la terminal désoxynucléotidyl-transférase (N. Expert-Bezancon, N. Jourdan, M. Delarue)

La terminal transferase appartient à la famille des polymérases beta (ou pol X). Elle est capable d'elonguer un "primer" (amorce) oligonucléotidique long d'au moins 3 bases, à partir des dNTP présents en solution, ajoutés aleatoirement puisque l'enzyme fonctionne sans matrice à recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de la génération d'une partie de la diversité du système immunitaire à travers l'elongation des régions N à la jonction V(D)J. Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie et de Génétique du Développement, est de caracteriser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-a-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le role des ions metalliques dans le site actif. Des cristaux diffractant à 2.4 A ont été obtenus et trois dérivés lourds ont été enregistrés, permettant ainsi le calcul d'une carte de densité électronique à 3.0 A de résolution. La carte a été interpretée et le modèle affiné avec un facteur d'accord de 21% (R-free 26%) à la résolution maximale des données. Les implications biologiques du modèle sont en cours d'analyse. Enfin, des cristaux de complexes binaires (TdT + oligonucleotide) et (TdT + ddNTP + Co++) ont été enregistrés et montrent de la densité électronique pour construire les differents substrats de l'enzyme dans le site actif.


Etude cristallographique des TMP kinases bactériennes (I. Li de la Sierra, A. Haouz, M. Delarue)

La TMP kinase est une cible potentielle nouvelle pour le design d'antibiotiques. En collaboration avec le Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolecules, nous avons cristallisé differentes TMP kinase bactériennes, dont celle de M. tuberculosis qui diffracte à 1.9 Angstrom de résolution et a été résolue par remplacement isomorphe. Son affinement est terminé et l'analyse de la structure en comparaison avec les autres structures de TMPK bacteriennes et d'eucaryotes a été effectuée. Nous nous attachons à l'étude cristallographique de différents complexes de cette protéine avec des inhibiteurs, ce qui nous permettra, à terme, d'affiner la synthèse d'antibiotiques potentiels. Parallelement, les caracteristiques enzymologiques de ces inhibiteurs potentiels sont determinées au laboratoire grace à un dosage direct par HPLC de tous les substrats et produits de la réaction.


Cristallisation de la protéine non-structurale NSP3 de rotavirus (N. Expert-Bezancon, M. Delarue)

La protéine NSP3 de rotavirus a été recemment caracterisée par le groupe de J. Cohen à l'INRA (Jouy-en-Josas); elle est responsable de l'adressage des RNA messagers viraux sur la machinerie de transcription de la cellule hote. Nous cherchons à cristalliser cette protéine complexéee à l'ARN viral, afin de mieux comprendre la nature des interactions mises en jeu. Nous avons recemment réussi à produire de grandes quantités de protéine soluble à 2-3 mg/ml, puis à la concentrer encore plus à 10 mg/ml en presence d'un oligonucléotide RNA substrat. Des essais de cristallisation sont en cours.


Nouvelle méthode d'affinement et de combinaison des phases en cristallographie (M. Delarue)

En collaboration avec H. Orland (CEA), nous avons derivé une nouvelle théorie de la combinaison de phase qui generalise tous les formalismes precedents. Des considerations thermodynamiques tres simples permettent d'estimer les poids relatifs des contraintes experimentales et celles derivees de la modification de densité.


Biocalorimétrie et thermodynamique structurale (F. Schaeffer, P.M. Alzari)

Les travaux de recherche en biocalorimétrie ont pour but la description quantitative des forces qui gouvernent la formation des complexes biomoléculaires. Cette approche, avec l'analyse structurale des molécules étudiées, ouvre la voie à la conception de molécules affines basée sur les principes de la thermodynamique. Les méthodes sont la calorimétrie de titration isotherme, la calorimétrie à balayage des températures, avec le développement de la thermodynamique statistique des interactions moléculaires qui permet la déconvolution des énergies d'association en termes structuraux. Les thèmes abordés sont l'interaction protéine-ligand et protéine-ADN. Ils comprennent l'étude de l'interaction des protéines dockerin et cohesin à la base de la formation du cellulosome bactérien (collaboration avec P. Béguin, IP); l'interaction de protéines tyrosine-kinases et son application à la conception de nouveaux immunosuppresseurs (collaboration avec O. Acuto, IP); l'interaction de facteurs sanguin humains impliqués dans la coagulation et son application à la conception d'anti-coagulants (collaboration avec C. Bon, IP; C. Mounier, Université Cergy-Pontoise; M. Gelb, Université de Washington); l'interaction de facteurs de transcriptions et de l'ADN promoteur de gènes impliqués dans la cancérisation et l'invasion tumorale (collaboration avec M. Aumercier et D. Sthéhelin, IP de Lille).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Fejt, Françoise - secrétaire IP

Alzari, Pedro M. - Chef de laboratoire IP

Delarue, Marc - CR1 CNRS

Schaeffer, Francis - Chargé de Recherche IP

Amaya, Maria Fernanda - Etudiante en thèse PhD student

Boitel, Brigitte - Post-doc

Buschiazzo, Alejandro - Post-doc

Gomes Guimaraes, Beatriz - Post-doc

Haouz, Ahmed - Post-doc

Mate Perez, Maria Jesus - Post-doc

Ortiz Lombardia, Miguel - Post-doc

Vatzaki, Efstratia - Post-doc

Vernazobres, David - Etudiante DEA

Expert-Besançon, Nicole - Ingénieur IP

Nguyen, Tong - Ingénieur IP

Souchon, Hélène - ITA CNRS

Tello, Diana - Ingénieur IP

Gehring, Kalle - Professeur visitant


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