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  Responsable : BARANTON GUY (gbaran@pasteur.fr)


  resume

 

En 2000, les travaux ont concerné la génétique expérimentale, l'immunité innée et le typage des Leptospires. Chez Borrelia turicatae a été étudiée la variation antigénique.
Chez les Yersinia, l'étude de l'ilôt de pathogénicité, le séquencage du génome de Yersinia pseudotuberculosis et la résistance aux antibiotiques ont été les principaux points abordés.



  rapport

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Introduction

L'Unité de Bactériologie Moléculaire et Médicale étudie principalement 3 genres bactériens pathogènes Leptospira, Borrelia (deux spirochètes) et Yersinia (une entérobactérie).
Les leptospires sont responsables d'une zoonose qui chez l'homme provoque une maladie aigue, souvent sévère parfois grave. La symptomatologie en est très variée: formes méningées, ictériques, rénales, hémorragiques… Une espèce saprophyte sert de bactérie modèle pour le développement de la génétique reverse. D'autres informations sont disponibles à l'adresse suivante: http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/LepF.html

Les Borrelia sont en Europe responsables de la maladie de Lyme, mais en zones tropicales d'autres Borrelia provoquent des fièvres récurrentes qui sont caractérisées par des accès fébriles itératifs à intervalles réguliers.

Le genre Yersinia comprend trois espèces pathogènes pour l'homme. Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, largement répandues dans tous les pays tempérés et froids, sont transmises par voie orale et sont responsables d'une symptomatologie digestive. Y. pestis est l'agent de la peste, maladie transmise par les puces et qui sévit sous forme endémo-épidémique en Afrique, Asie et Amérique.

LEPTOSPIRES

Des outils génétiques pour le genre Leptospira I. Saint Girons, P. Bourhy, C. Ottone, M. Picardeau, D. Yelton, R. Hendrix, P. Glaser, N. Charon

Les outils génétiques étaient inexistants jusqu'à maintenant pour le genre Leptospira. Nous avons tout d'abord construit un vecteur navette L. biflexa-E. coli avec les caractéristiques suivantes: (i) un fragment de 2.2 kb de l'ADN du leptophage LE1 qui contient son origine de réplication (ii) une cassette de résistance à la kanamycine de Enterococcus faecalis (iii) une origine de réplication d' E. coli. Un échange allélique a ensuite été obtenu pour le gène de la flagelline (flaB) de L. biflexa, une souche saprophyte. Les mutants flaB: kanR obtenus ont un phénotype de mobilité
réduite. Des expériences sont en cours pour inactiver d'autres gènes et étendre ces résultats aux leptospires pathogènes.

Dispersion des gènes méthionine sur les deux chromosomes de Leptospira, P. Bourhy, I. Saint Girons

Le gène metF est situé sur le chromosome secondaire CII, en contraste avec la localisation des gènes metY et metX sur le chromosome CI de Leptospira sp. Ces données de dispersion des gènes de biosynthèse de la méthionine sur
les deux chromosomes de Leptospira indiquent un lien fonctionnel entre les deux chromosomes du génome.

Protéines liant la pénicilline chez les Leptospires A. Brenot, D. Trott, I. Saint Girons, R. Zuerner

Six protéines qui fixent la pénicilline ("PBP") ont été mises en évidence chez L. interrogans par un test fonctionnel. Les gènes ponA et pbpB, qui codent PBP1 et PBP3, ont été isolés. Les protéines PBP1 et PBP3 de L. interrogans sont synthétisées chez E. coli et modifiées avec l'ampicilline utilisant un conjugué digoxygénine-ampicilline. Ces données montrent que les deux gènes codent des protéines fonctionnelles fixant la pénicilline.

Les leptospires activent les cellules par un mécanisme dépendant de CD14 et du récepteur "Toll-like 2" (TLR2) C. Werts, R.I. Tapping, J.C. Mathison, T.H. Chuang, V. Kravchenko, I. Saint Girons, D.A. Haake, P.J. Godowski, F. Hayashi, A. Ozinsky, D.M. Underhill, C.J. Kirschning, H. Wagner, A. Aderem, P.S. Tobias, R.J. Ulevitch

Les pathogènes bactériens activent le système d'immunité innée de l'hôte via des récepteurs "Toll-like" qui reconnaissent des motifs bactériens conservés comme, par exemple, les lipopolysaccharides (LPS) ou les
lipoprotéines. Contrairement au LPS des bactéries à Gram-négatif, le LPS des leptospires est peu endotoxique. Nous avons montré que le LPS de Leptospira interrogans active les macrophages via les récepteurs CD14 et
TLR2, mais ne semble pas dépendre du récepteur TLR4, qui joue un rôle central dans la reconnaissance des LPS des bactéries à Gram-négatif. Ces données présentent une nouvelle base pour la compréhension de la réponse
immunitaire innée pendant l'infection par L. interrogans, ainsi qu'un nouveau ligand pour TLR2.

Les cas groupés de leptospirose en milieu urbain tropical au Brésil sont liés à des expansions clonales de sérovars de leptospires M.M. Pereira, M.G.S. Matsuo, A.R. Bauab, S.A. Vasconcelos, Z.M. Moraes, G. Baranton, I. Saint Girons

Curieusement, alors qu'il n'y a pas transmission interhumaine, les cas groupés dans le temps et dans l'espace (improprement appelés "épidémie"), survenant lors d'inondations dans les grandes métropoles brésiliennes, sont liés à un sérovar dominant. Nous avons pu identifier 44 souches provenant d'épisodes "épidémiques" à Sao Paulo en 1994 et 1995 : 38 sont des icterohaemorrhagiae et 6 des canicola. Ceci montre que, bien que les sources d'infection proviennent d'animaux différents, ce sont des clones leptospiriens qui sont infectants.

Leptospires présents aux Açores Cao Thi Bao Van, G. Baranton

Des cas de leptospirose ont été récemment objectivés dans l'archipel des Açores. En collaboration avec des collègues portugais et hollandais, nous avons contribué à dresser l'inventaire des sérovars présents dans ces îlots volcaniques de la dorsale atlantique.

Une adhésine de Leptospira F. Merien, J. Truccolo, G. Baranton, P. Perolat

Faisant suite aux travaux précédents concernant les interactions Leptospira interrogans-cellule hôte qui objectivaient un phénomène d'adhésion, nous avons cherché une adhésine potentielle à une protéine de la matrice extra-cellulaire : la fibronectine. Nous avons pu caractériser les interactions sur membrane entre la fibronectine humaine et une protéine de 36 kd présente chez L. interrogans. Cette protéine (sensible à la protéinase K), absente chez L. biflexa (saprophyte), se fixerait sur le domaine "gelatin binding" de la fibronectine.


Non pathogénicité de L. meyeri D. Postic, N. Sertour, F. Merien, P. Perolat, G. Baranton

Paradoxalement, si de nombreux moyens permettent d'aborder l'identification des sérovars, l'identification des espèces chez Leptospira reste difficile et, en pratique, n'est presque jamais effectuée. Il en résulte un certain nombre de controverses. Le cas de L. meyeri en est un exemple. Cette espèce comprend des sérovars isolés des grenouilles, d'eaux de surface, ou de mammifères. En Europe, elle était habituellement considérée comme pathogène alors qu'aux Etats-Unis, elle était décrite comme saprophyte. Une étude complète nous a montré que les souches types des sérovars la composant n'étaient pas les mêmes en Europe et aux USA. Les souches constituant ces sérovars en Europe ont pu être rapportées à d'autres espèces, de fait pathogènes, alors qu'aux USA il s'agissait de souches qui, à une exception près se regroupaient bien ensemble au sein de l'espèce L. meyeri qui phylogénétiquement trouve sa place parmi les saprophytes. Ces résultats ont été obtenus par séquençage de l'amplicon utilisé en PCR diagnostique qui sur 330 pb du gène rrs codant l'ARNr16S comporte 50 % du polymorphisme de la totalité du gène. Ceci nous procure un moyen d'identification de l'espèce chez Leptospira.

BORRELIA

Variation antigénique chez B. turicatae N. Marti Ras, D. Postic, P. Ave, M. Huerre, G. Baranton

Borrelia turicatae est l'un des modèles utilisés pour étudier la variation antigénique chez les Borrelia, agents de fièvre récurrente. In vivo, expérimentalement de nouveaux sérotypes liés à la protéine émergent régulièrement remplaçant le précédent et donnant lieu à un nouvel accès fébrile. La sélection du nouveau variant est dûe à la pression anticorps.
Nous avons cultivé itérativement une souche clonée. Régulièrement ont été effectuées sur des clones des électrophorèses en champ pulsé qui ont montré à quatre reprises des réarrangements plasmidiques. Chacun de ces clones dont la protéine Vsp a été séquencée s'est révélé appartenir à un nouveau sérotype. Inoculé à l'animal, chacun de ces sérotypes a montré un organotropisme particulier.

CNR et CCOMS des Leptospires E. Fournié, N. Sertour, E. Bellenger, P. Bourhy, D. Postic, G. Baranton
http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/lepto-index.html

Au plan de l'endémie leptospirienne, l'année 2000 a été marquée par un nombre modeste de cas : 268 en métropole, correspondant de fait à une circulation réduite des leptospires, et 266 dans les DOM-TOM où la réalisation des diagnostics de leptospirose a connu quelques vicissitudes. Des détails sont disponibles sur le serveur leptospires. http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/Leptospira.F.html
A noter la survenue cette année de cas groupés. Tout d'abord une équipe engagée dans le raid Eco Challenge 2000 en Malaisie : les 4 membres de l'équipe française ont présenté à leur retour une leptospirose (au total, 158 des 304 participants ont souffert de cette infection). L'autre épisode a intéressé 5 militaires qui, en Martinique, ont participé à des manoeuvres en brousse.
En 2000 a été publiée une nouvelle version bilingue (anglais-français du Manuel : Diagnostic biologique : Leptospirose - Borréliose de Lyme par D. Postic, F. Merien, P. Perolat, G. Baranton, Série "Méthodes de Laboratoire". http://www.pasteur.fr/infosci/manuels/edlept12ed.html

Commission des Laboratoires de Référence et d'Expertise (CLRE), Institut Pasteur, Paris, 2e Edition, Français : 135 p., Anglais : 113 p. Cette édition comporte notamment les protocoles d'exécution des methodes moléculaires d'identification et de détection de Leptospira et Borrelia.

Laboratoire des Legionella et Francisella C. Tram

Au cours de l'année 2000, une centaine de souches (L. pneumophila en très grande majorité) ont été isolées et identifiées, notamment au plan de la pathogénicité (PCR sur le gène MIF) De même, une cinquantaine de souches de Francisella tularensis ont été identifiées à partir de cultures de prélèvements animaux (Maisons-Alfort) et 5 souches de patients atteints de tularémie (ganglions)

YERSINIA (Responsable: Elisabeth Carniel)

Le genre Yersinia comprend 3 espèces pathogènes pour l'homme: les espèces entéropathogènes Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, et l'agent de la peste, Y. pestis.

Les principaux axes de travail du laboratoire des Yersinia sont:



- la caractérisation d'un îlot de pathogénicité qui confère aux souches qui l'hébergent la capacité de provoquer des infections systémiques chez l'homme et l'animal.
- les bases moléculaires du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Pour cela, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis, bactérie "jumelle" mais de virulence bien moindre, est en cours. Une comparaison "gène par gène" des deux génomes pourra ainsi être effectuée.
- les relations de Y. pestis avec son insecte vecteur, la puce.
- la physiopathologie de l'infection à Yersinia.
- l'évolution de Y. pestis depuis son apparition récente à partir de Y. pseudotuberculosis.
- la résistance aux antibiotiques et l'évaluation de nouveaux traitements.
- la santé publique au niveau national (Centre National de Référence) et international (Centre Collaborateur de l'OMS).


Les travaux ayant fait l'objet de publications en 2000 sont les suivants:

1. Caractérisation de l'îlot de haute pathogénicité des Yersinia

Depuis quelques années, la notion de régions chromosomiques étrangères qui portent des gènes impliqués dans la virulence et qui ont été appelées "îlots de pathogénicité" a émergé. Leur capacité d'excision spontanée du chromosome, leur GC% différent de celui du reste du génome et la présence d'une intégrase de type phagique dans certains cas suggèrent qu'ils ont été acquis de manière horizontale par l'intermédiaire de bactériophages. Certaines Yersinia pathogènes hébergent une telle structure, appelée "îlot de haute pathogénicité" (HPI) car elle confère un haut degré de pathogénicité (infections systémiques chez l'homme, létales chez la souris). Notre laboratoire étudie l'HPI des 3 espèces pathogènes de Yersinia.

1.1. Caractérisation de séquences répétées présentes sur l'HPI de Y. enterocolitica
I. Guilvout et E. Carniel

Collaborateurs extérieurs: A. Rakin, S. Schubert,et J. Heesemann
Sur l'HPI de Y. enterocolitica se trouve un cluster de 3 séquences répétées qui ne sont pas présentes sur l'HPI des deux autres espèces de Yersinia très pathogènes. L'analyse de la troisième séquence répétée a montré que comme pour les 2 autres (IS1400 et IS1328), il s'agit encore d'une IS (IS1329) de la famille IS3. Cette séquence est elle même insérée dans les vestiges d'une quatrième IS (IS1222) de la famille IS3. Cette région A+T riche de l'HPI est donc un hot spot d'intégration de séquences d'insertion de la famille des IS3.

1.2. Distribution de l'îlot de haute pathogénicité des Yersinia au sein des entérobactéries.
S. Bach, A. de Almeida, E. Carniel
L'HPI des Yersinia avait été précédemment identifié chez différents pathotypes de E. coli pathogènes. Nous l'avons identifié chez d'autres genres de la famille des entérobactéries: Citrobacter diversus et plusieurs espèces de Klebsiella, chez lesquels il semble fonctionnel. A quelques exceptions près, l'HPI est très bien conservé chez ces différents genres bactériens et est inséré, comme chez les Yersinia, au niveau du locus asnT. L'HPI est pour l'instant le seul exemple d'un îlot de pathogénicité présent et conservé chez des espèces et des genres bactériens différents.


2. Résistance aux antibiotiques et traitement

2.1. Analyse des ß-lactamases produites par l'espèce Y. enterocolitica L. Martin et E. Carniel

Collaborateurs extérieurs: J. Pham et S. M. Bell
Y. enterocolitica porte naturellement deux gènes chromosomiques codant une pénicillinase et une céphalosporinase produites de façon constitutive. Une analyse extensive d'un grand nombre de souches de Y. enterocolitica de différents biotypes et sérotypes a montré que cette sensibilité est directement liée à la présence et aux types de béta-lactamases produites: enzyme A ou A-like pour la pénicillinase, et B ou B-like pour la céphalosporinase. Il existe de plus une étroite corrélation entre les types d'enzymes produites et les caractéristiques phénotypiques des souches.

2.2. Évaluation de nouveaux traitements de la peste:A. Guiyoule et E. Carniel

Collaborateurs extérieurs: L. Rahalison, S. P. Bonacorsi, I. Slacanin, S. Chanteau
Les antibiotiques classiquement utilisés pour le traitement de la peste sont la streptomycine et les tétracyclines. Ces traitements, bien qu'efficaces, posent des problèmes pratiques d'utilisation. Le chloramphénicol huileux en traitement minute étant très efficace lors des méningites bactériennes en Afrique, nous avons évalué l'effet d'un traitement minute de la peste par cet antibiotique dans un modèle expérimental murin. Cette étude ont montré que l'injection d'une ou deux doses de chloramphénicol huileux ne permettait pas de traiter efficacement les animaux infectés. Cependant, la demi-vie sérique de cet antibiotique chez la souris étant bien plus courte que celle observée chez l'homme, les résultats obtenus chez l'animal ne peuvent être transposés à l'homme.


3. Analyse du polymorphisme des acides gras de paroi de Y. pestis A. Guiyoule et E. Carniel

Collaborateurs extérieurs: A. Leclerq, M. El Lioui, et J. Decallonne
L'étude de la composition en acide gras des parois bactériennes est un moyen de différencier des espèces et d'étudier leur degré de polymorphisme. L'analyse des acides gras de paroi de souches de Y. pestis variées a démontré une très grande homogénéité de ces constituants lipidiques de paroi. Ell a aussi permis la distinction des Yersinia en 3 groupes: le premier constitué des espèces non pathogènes, le second formé des Y. enterocolitica pathogènes, et le troisième regroupant les espèces Y. pestis et Y. pseudotuberculosis. Ces résultats confirment le lien phylogénétique étroit entre Y. pseudotuberculosis et Y. pestis et la grande homogénéité de cette dernière espèce.

4. Centre National de Référence des Yersinia et Centre Collaborateur de l'OMS

Le CNR des Yersinia a des activités de recherche appliquées à l'épidémiologie, à la thérapeutique et au diagnostic clinique: description de formes cliniques inhabituelles de yersinioses, élaboration de nouvelles techniques de diagnostic biologique, amélioration des méthodes de caractérisation des souches. L'activité du centre collaborateur OMS porte sur le typage des souches isolées du monde entier, la conservation de ces souches, la fourniture de matériel biologique, de protocoles, de conseils pratiques ou de références bibliographiques, la formation de stagiaires étrangers, et la formulation de recommandations. Le centre participe de plus à des missions sur le terrain.

5. Programme de séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis

Le génome de Y. pestis a été très récemment séquencé par le Sanger Centre. Nous pensons qu'une analyse comparative du génome de Y. pestis et de Y. pseudotuberculosis (bactérie génétiquement très proche de Y. pestis mais de virulence bien moindre) pourrait aider à l'identification de gènes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Une collaboration entre le Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) aux États-Unis et notre laboratoire a été établie pour le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis. La partie séquençage proprement dite est en cours au LLNL. Notre laboratoire effectue la partie pré-séquençage (banque BAC ordonnée, fourniture d'ADN) et post-séquençage (analyse des différences entre les 2 génomes, distribution des allèles au sein des 2 espèce, analyse du rôle de ces régions sur la pathogénicité).



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