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  Responsable : Georges RAPOPORT (rapoport@pasteur.fr)


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L'Unité de Biochimie Microbienne a poursuivi l'étude de la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives modèles (Bacillus, Streptomyces ) et a élargi récemment son domaine de recherche à l'étude des facteurs de virulence chez des bactéries Gram-positives pathogènes ( Listeria , Streptocoques, Staphylocoque).



  rapport

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Etude du régulon sigma 54 de B. subtilis (M. Débarbouillé, N. Ould Ali, M. Arnaud, J. Bignon)

Le gène sigL code pour un facteur sigma homologue de sigma 54 des bactéries Gram-négatives. Sigma L est requis pour l'utilisation d'amino acides comme sources d'azote (arginine, ornithine, isoleucine et valine) et de sucres comme sources de carbone (fructose). Les gènes régulateurs spécifiques impliqués dans ces métabolismes ont été identifiés. Ils stimulent la transcription en se fixant sur des séquences localisées en amont (UAS) ou en aval (DAS) des promoteurs s54 de type —12/-24. L'opéron acoABCL impliqué dans le catabolisme de l'acétoïne, composé majeur de la dégradation du glucose, a été analysé en détail ainsi que son régulateur spécifique, AcoR. De plus, l'expression de cet opéron est fortement réprimée par le glucose via le régulateur transcriptionnel de la répression catabolique, CcpA, qui agit sur une séquence cible spécifique, CRE, située en amont du gène acoR.

Réponse aux stress (T. Msadek, A. Chastanet, I. Derré)

Nous avons montré que les gènes de choc thermique codant pour les sous-unités catalytiques et régulatrices Clp de la protéase ATP-dépendante de B. subtilis sont sous le contrôle du répresseur CtsR. Une analyse comparative des séquences génomiques disponibles indique que la protéine CtsR et ses séquences cibles sont fortement conservées parmi les bactéries Gram-positives à faible contenu en GC, dont certaines pathogènes (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis).

Ces expériences réalisées in vivo (fusions de gènes chez B. subtilis) et in vitro (retards de migration, empreintes à la DNAse I), indiquent que chez S. pneumoniae, l'expression de l'opéron codant pour les protéines chaperons GroESL dépend à la fois de CtsR et d'un autre régulateur global, HrcA. Chez S. aureus, l'ensemble du régulon HrcA (qui comprend les opérons groESL et dnaK) est inclus dans le régulon CtsR, qui contrôle par ailleurs l'expression des gènes clpP, clpB et l'opéron clpC.

L'étude de la régulation par CtsR des gènes clp de L. moncytogenes, effectuée en collaboration avec l'équipe de P. Berche (Faculté de Médecine, Necker, Paris), a montré que CtsR intervient dans la résistance à différents stress. Son rôle a été testé dans un modèle murin. La présence de CtsR en multicopies chez Listeria entraîne dans ce cas une diminution significative de la virulence, vraisemblablement due à une répression des gènes clp.

Transduction de signaux (T. Msadek, E. Guédon, B. Fournier, P. Mazodier, J. Viala, A. Sobczyk)

Une analyse du transcriptome de B. subtilis sous la dépendance du système à deux-composants DegS/DegU a été entreprise à l'aide de membranes contenant l'ensemble du génome (4200 gènes). Environ 80 gènes sont contrôlés par ce système et la majorité d'entre eux, dont la plupart organisés en opérons, est réprimée. Il avait été montré auparavant que DegS/DegU contrôle la synthèse d'enzymes dégradatives et la compétence (intégration d'ADN).

L'étude d'un autre système de transduction de signal à deux-composants de B. subtilis, LytS/LytT, analogue à celui de S. aureus a été entreprise. Contrairement à S. aureus, il n'intervient pas dans l'expression des autolysines. Un opéron de 2 gènes adjacents à LytS/LytT a déjà été identifié sous le contrôle de ce système. D'autres gènes appartenant à ce régulon seront identifiés par analyse du transcriptome.
Chez S. aureus, un système à deux-composants, ArlS/ArlR, intervenant dans la virulence de cette bactérie, a été analysé. La délétion du locus arl provoque une très forte augmentation de la protéine A et également d'autres protéines sécrétées :a-toxine,b-hémolysine, lipase, coagulase, protéase à sérine. Le système ArlS/ArlR est lui-même contrôlé positivement par les 2 loci majeurs de virulence de S. aureus, sarA et agr. Réciproquement, le système Arl active l'expression de sarA mais réprime celle de agr.

Chez les Streptomyces, les protéines chaperons GroES, GroEL1 et GroEL2 sont comme chez B. subtilis, sous la dépendance du répresseur HrcA qui agit sur des séquences cibles, CIRCE. Deux nouveaux régulateurs ont été caractérisés chez S. albus : HspR qui réprime l'expression de l'opéron dnaK, du gène clpB et du gène lon, et RheA qui réprime l'expression de la protéine majeure de choc thermique Hsp18. Leurs séquences cibles ont également été définies : il s'agit de séquences répétées inversées spécifiques de 7 pb. Il a été montré de plus que RheA est inactivée par la chaleur de manière réversible et que ce régulateur agit comme un thermomètre cellulaire.

Par ailleurs, les gènes codant pour les sous-unités ClpP, ClpX et ClpC ont été caractérisés. Chez S. lividans, quatre gènes clpP sont présents : clpP1 et clpP2 sont organisés en tandem, alors que clpP3 et clpP4 forment un opéron sous le contrôle d'un nouvel activateur, PopR qui agit sur une séquence cible palindromique de 6 pb. Le système Clp intervient dans la différenciation morphologique chez S. lividans, S. albus et S. coelicolor, tandis que ClpX contrôle la production d'un antibiotique, l'actinorhodine, chez S. lividans et S. coelicolor.

Nous avons poursuivi l'étude des protéases ATP-dépendantes par la caractérisation de Lon. Cette étude a montré que Lon, contrairement au complexe Clp, n'était pas directement impliquée dans la régulation de la différenciation. L'obtention d'un mutant lon sera exploitée dans le cadre d'un projet européen pour la production de protéines hétérologues.


Régulation de l'expression des gènes de virulence chez B. thuringiensis et B. cereus (D. Lereclus, L. Slamti, M. Gominet, S. Fedhila-Hamza)

La protéine plcR est un régulateur pléiotrope de l'expression des facteurs de virulence chez ces 2 microorganismes (pathogène des insectes et pathogène humain, respectivement). Il intervient en activant la transcription d'au moins 15 gènes codant pour des protéines extracellulaires (phospholipases C, protéases, hémolysine, entérotoxines). L'interruption de ce gène diminue fortement les propriétés hémolytiques et cytolytiques de B. thuringiensis et B. cereus. Chez les insectes cibles (Lépidoptères), le mutant réduit l'effet synergique des spores des 2 Bacillus vis-à-vis de l'activité insecticide des protéines du cristal de B. thuringiensis. Chez la souris, la mortalité causée par l'instillation nasale des spores de B. thuringiensis et de B. cereus, est également fortement diminuée ou abolie avec le mutant plcR. L'expression de plcR qui a eu lieu en début de phase stationnaire, est autorégulée, et est contrôlée négativement par le gène du déclenchement de la sporulation, spo0A. L'expression de PlcR dépend également d'un système de " quorum sensing " de type transporteur ABC impliqué dans la perméation d'oligopeptides (système Opp). La nature des peptides intervenant dans l'activité intercellulaire et leur mécanisme d'action sont en cours d'analyse.

Par ailleurs, 2 gènes clpP ont été caractérisés chez B. thuringiensis. Ces gènes ont été interrompus, et leur rôle dans la sporulation et dans la virulence chez l'insecte est en cours d'étude.

Régulation de l'expression de toxines insecticides sécrétées par Bacillus thuringiensis (V. Sanchis, S. Espinasse)

L'analyse, par mutagénèse insertionnelle, d'une souche surproductrice deb-exotoxine, un analogue de l'ATP à activité insecticide qui inhibe l'activité de l'ARN polymérase, a permis d'identifier un transporteur ABC ainsi qu'un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function) qui pourraient être impliqués dans l'expression et l'exportation de lab-exotoxine. L'interruption des gènes codant pour ces protéines conduit à un phénotype avirulent. L'expression du gène du facteur sigma ECF est auto-régulée et son niveau de transcription est plus élevé dans la souche surproductrice que dans la souche parentale non toxique. La recherche d'autres gènes éventuellement contrôlés par ce facteur sigma est actuellement en cours ; elle devrait nous permettre d'identifier et d'étudier la fonction de gènes qui ne sont pas exprimés dans les conditions standard de culture mais dont l'expression coordonnée est induite dans des situations particulières, propres à l'écologie de la bactérie.

Légende de la photo:

Analyse du régulon DegS/DegU chez Bacillus subtilis par l'étude du transcriptome. L'ensemble des 4107 gènes de Bacillus subtilis est présent sur une membrane à haute densité. Les points rouges indiquent les gènes dont l'expression est réprimée par DegU, les points verts ceux dont l'expression est activée par le système DegS/DegU, les points jaunes les gènes qui ne sont pas contrôlés par DegU et les points noirs les gènes qui ne sont pas exprimés dans les conditions utilisées.



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DUGAST Christine, Secrétaire de Direction IP

DEBARBOUILLE Michel, DR2 CNRS mdebarbo@pasteur.fr

FOURNIER Bénédicte, Chargé de Recherche IP bfournie@pasteur.fr

KLIER André, Professeur Université Paris 7 aklier@pasteur.fr

LERECLUS Didier, DR1 INRA lereclus@pasteur.fr

MAZODIER Philippe, Chef de Laboratoire IP mazodier@pasteur.fr

MSADEK Tarek, Chargé de Recherche IP tmsadek@pasteur.fr

RAPOPORT Georges, DR1 CNRS, Professeur IP, rapoport@pasteur.fr

SANCHIS Vincent, INRA vsanchis@pasteur.fr

BRAUD Sandrine, Chercheur post-doctoral

CHASTANET Arnaud, Etudiant en thèse

ESPINASSE Sylvain, Etudiant en thèse

FEDHILA-HAMZA Sinda , Etudiante en thèse

GUEDON Eric, Chercheur post-doctoral

OULD ALI Naima, Etudiante en thèse

ROBICHON Denis, Stagiaire post-doctoral

SLAMTI Leyla, Etudiante en thèse

SOBCZYK André, Stagiaire post-doctoral

VIALA Julie, Etudiante en thèse

ARNAUD Maryvonne, Ingénieur de Recherche IP

BIGNON-TOPALOVIC Joëlle, Technicienne Supérieure IP

DUGAST Christine, Secrétaire de Direction IP

FERT Julie, Technicienne Université Paris 7

GOMINET Myriam, Technicienne Supérieure IP


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