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  Bioregim


  Responsable : LECLERC Claude (cleclerc@pasteur.fr)


  resume

 

L'activité de l'Unité est centrée sur la compréhension des mécanismes qui contrôlent la présentation des antigènes aux lymphocytes T par les cellules dendritiques, l'activation de réponses T et la mise au point de nouvelles stratégies vaccinales. Nous avons récemment développé plusieurs stratégies d'activation de réponses T cytotoxiques anti-virale et anti-tumorale, basées sur la capacité de certaines molécules exogènes à pénétrer dans le cytoplasme des cellules présentatrices d'antigène et à y délivrer des épitopes T, CD8+. Un autre objectif de l'Unité est de construire des glycopeptides synthétiques portant des motifs saccharidiques et permettant d'induire des réponses anti-tumorales.



  rapport

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L'adénylcyclase de Bordetella pertussis : un nouveau vecteur ciblant les cellules dendritiques (collaboration avec D. Ladant, Unité de Biochimie Cellulaire, et P. Sebo, Prague)

1. Identification du récepteur de l'adénylcyclase (P. Guermonprez, M. El-Azami El-Idrissi)

L'adénylcyclase (CyaA) est l'une des toxines essentielles de Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Elle joue un rôle primordial dans la phase précoce de l'invasion pulmonaire. Cette toxine possède la capacité à pénétrer dans les cellules eucaryotes où, activée par la calmoduline, elle catalyse une production massive d'AMPc et altère ainsi le métabolisme cellulaire. Elle possède des effets toxiques prononcés sur les macrophages et les neutrophiles. Nous avons démontré que la CyaA utilise l'intégrine CD11b/CD18 comme récepteur cellulaire. En effet, la fixation de la CyaA sur différentes cellules hématopoiétiques est en parfaite corrélation avec la présence de l'intégrine CD11b/CD18 sur ces cellules. De plus, la liaison de cette toxine à différentes lignées cellulaires murines et à des neutrophiles humains est inhibée par un anticorps monoclonal anti-CD11b. Ce dernier bloque également l'augmentation de l'AMPc intracellulaire et la cytotoxicité induites par cette toxine. En outre, la CyaA se fixe de façon très efficace à des cellules CHO transfectées par l'intégrine CD11b/CD18 mais non à des cellules non transfectées ou transfectées avec l'intégrine CD11c/CD18. Compte-tenu que CD11b est exprimé principalement par les macrophages, les neutrophiles, les cellules dendritiques et les cellules NK, son interaction avec la cyclase pourrait jouer un rôle important dans la perturbation de la réponse antibactérienne. De plus, le fait que CyaA cible spécifiquement les cellules dendritiques en fait un vecteur très efficace pour délivrer des antigènes à ces cellules (collaboration avec l'Unité des Bordetella).


Induction de réponses T cytotoxiques antivirale et antitumorale (C. Fayolle et G. Dadaglio)

Nous avons analysé la capacité de CyaA recombinantes portant une à quatre copies d'un épitope T du LCMV restreint par les molécules de classe I et II à induire des réponses T. Ces CyaA recombinantes sont capables d'induire à la fois des réponses CTL et T CD4+ de type Th1 contre cet épitope en absence ou en présence d'adjuvant. Bien que l'insertion de longs peptides conduise à une perte partielle de la capacité invasive de la CyaA recombinante, l'insertion de plusieurs copies d'un même épitope augmente fortement la réponse Th1 et, à moindre degré, la réponse CTL.
La capacité de la toxine CyaA à induire des réponses CTL dirigées contre des épitopes humains a aussi été étudiée. Plusieurs CyaA recombinantes portant des épitopes de mélanomes restreints par HLA-A2 ont été produites et testées sur des souris transgéniques exprimant la molécule HLA-A2 (collaboration avec F. Lemonnier, IP). De fortes réponses CTL spécifiques dirigées contre ces épitopes ont été caractérisées chez les souris immunisées. Ces réponses ont pu être détectées jusqu'à 5 mois après l'immunisation, démontrant que la CyaA induit des réponses mémoires de longue durée.
Nous avons analysé également la faisabilité d'un vaccin polyépitopique construit à partir de la toxine CyaA, en insérant une séquence polyépitopique modèle codant pour 3 épitopes T CD8+ dérivés du LCMV, de la boucle V3 du VIH1 et de l'ovalbumine dans différents sites permissifs de l'extrémité N-terminale de la toxine. La présentation des épitopes a été étudiée in vitro à l'aide d'hybridomes T, CD8+ spécifiques de ces épitopes et a permis d'établir que les épitopes insérés dans CyaA étaient correctement apprêtés et présentés par les cellules présentatrices de l'antigène (CPA). En outre, nous avons montré que de fortes réponses cytotoxiques étaient induites chez les souris immunisées contre chacun des épitopes quelle que soit leur position dans la toxine. La capacité de ces protéines recombinantes polyépitopiques à induire une protection contre l'infection par le virus LCMV a été également mise en évidence (collaboration avec M.F. Saron, IP). De plus, la pré-immunisation des souris par la toxine de type sauvage ou une toxine recombinante portant un épitope CTL n'affecte pas la réponse cytotoxique contre un autre épitope CTL inséré dans la toxine. Cette étude expérimentale constitue donc une étape importante pour le développement de vaccins polyvalents visant à stimuler des réponses cytotoxiques multispécifiques.

L'ensemble de ces résultats a mis en évidence le fort potentiel de cette toxine à induire des réponses immunitaires et met en évidence l'intérêt du développement de cette toxine à des fins vaccinales chez l'homme.


B. Etude des mécanismes de délivrance de pseudo-particules virales exogènes dans la voie des molécules du CMH de classe I (G. Moron)

Des pseudo-particules virales produites par l'auto-assemblage de la protéine VP2 (PPV-VLPs) et portant des épitopes hétérologues sont capables d'induire de fortes réponses T CD4+ et CD8+ en absence d'adjuvant. Etant donné que les antigènes exogènes ne sont pas normalement délivrés dans la voie de présentation par les molécules du CHM de classe I, ces PPV-VLPs représentent un système très prometteur pour l'activation des réponses T cytotoxiques. Nous avons montré que seules les cellules dendritiques (CD) sont capables de présenter des épitopes CD8+ portés par des PPV-VLPs, à des hybridomes T spécifiques. Les PPV-VLPs sont très rapidement capturés par les CD et persistent dans ces cellules, au moins pendant 24 heures. Les PPV-VLPs suivent une voie non conventionnelle d'apprêtage de type CMH I, impliquant la macropinocytose, des protéases lysozomales, mais aussi le protéasome et les molécules TAP (collaboration avec I. Casal, Ingenasa, Madrid).


C. Analyse des réponses CTL et Th induites par différentes sous-populations de cellules dendritiques (G. Dadaglio et G. Schlecht)

Il est maintenant parfaitement établi que les cellules dendritiques représentent les seules CPA capables d'activer des réponses immunitaires primaires. Deux sous-populations de CD ont été identifiées et caractérisées sur la base de l'expression différentielle de la molécule CD8a. D'importantes différences fonctionnelles et de localisation ont été décrites entre ces deux sous-populations.Nous avons analysé les réponses CTL activées dans le contexte d'une réponse T CD4+ simultanément induite par les sous-populations CD, CD8a+ ou CD8a-. Nous avons montré que chacune des sous-populations est capable d'induire une activité CTL bien que la sous-population CD8a+ semble être moins efficace. De plus, l'induction de cette activité CTL est indépendante de la réponse T CD4a+. Nous n'avons pas observé de réelle polarisation de la réponse Th suivant les CD utilisées pour l'immunisation, puisqu'une production des cytokines de type 1 et 2 a été observée dans tous les cas, malgré un plus haut taux de cytokines de type 2 induit par les CD CD8a-. L'ensemble de ces résultats indique que les deux sous-populations de CD peuvent être utilisées indifféremment dans des protocoles d'immunothérapie.


D. Etude du rôle des diverses CPA dans l'induction de réponses T, CD4+ anti-mycobactériennes (R. Lo-Man et X. Jiao)

Au cours d'une infection bactérienne, les cellules phagocytaires jouent un rôle central puisqu'elles sont directement impliquées dans l'élimination de l'agent bactérien et donc dans le contrôle de l'infection. Dans ce processus, le déclenchement de la réponse lymphocytaire T est primordial puisqu'elle contribue par la production de cytokines, à augmenter l'activité bactéricide des cellules phagocytaires et permet d'établir une mémoire immunologique. Nous avons donc entrepris l'évaluation, lors des étapes précoces de l'infection par M. bovis BCG, de la contribution de deux populations, les macrophages et les cellules dendritiques, au développement d'une réponse immunitaire T CD4+. L'ensemble des résultats obtenus mettent en évidence le rôle prépondérant joué par les cellules dendritiques. Il est à noter que dans les 24 heures suivant l'infection, la production d'IL-12 est associée uniquement aux cellules dendritiques, qu'elles soient CD8a+ ou CD8a-, mettant en évidence la contribution importante de ces cellules dans le développement de l'immunité anti-mycobactérienne, qu'elle soit innée ou acquise. (collaboration avec l'Unité de Génétique Mycobactérienne, IP).


E. Elaboration d'un composé synthétique portant un motif saccharidique d'origine tumorale à des fins thérapeutiques et vaccinales (R. Lo-Man et E. Dériaud)

Parmi les marqueurs saccharidiques associés à des cellules tumorales, on retrouve le motif Tn (alpha-N-acetyl-galactosamine) associé aux protéines de type mucine. Nous avons entrepris, en collaboration avec S. Bay et S. Vichier-Guerre (IP), l'élaboration d'un immunogène synthétique utilisant la structure d'un MAP (multiple antigenic peptide) contenant ce motif Tn sous forme de monomère, dans le but d'induire des réponses immunitaires anti-tumorales contre ce motif à des fins thérapeutiques et vaccinales. L'injection de ce composé MAG:Tn (multiple antigenic glycopeptide) à des souris conduit notamment à la production d'anticorps dirigés contre le motif Tn, capables de reconnaître ce motif à la surface de différentes cellules tumorales humaines et murines. Nous avons par la suite développé le MAG en incorporant un trimère Tn qui s'est révélé beaucoup plus immunogène que le composé initial. En effet, une vaccination prophylactique réalisée avec ce composé MAG:Tn3 permet de protéger les souris contre la greffe d'un adénocarcinome mammaire exprimant l'antigène Tn. De plus, lorsqu'un traitement thérapeutique est réalisé avec ce composé chez des souris porteuses d'une tumeur préétablie, il permet d'accroître de façon très importante la survie de ces souris. Sur la base de ces résultats, nous développons actuellement des composés utilisables chez l'homme.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Servanne Pires, IP (spires@pasteur.fr)

Gilles Dadaglio, IP (gdadag@pasteur.fr)

Claude Leclerc, IP (cleclerc@pasteur.fr)

Richard Lo-Man, IP (rloman@pasteur.fr)

Laleh Majlessi, IP (lmajless@pasteur.fr)

Florence Boisgérault, post-doctorante

Mohammed El-Azami El-Idrissi, post-doctorant

Gabriel Moron, post-doctorant

Hossain Motieian Najar, post-doctorant

Géraldine Schlecht, thèsard

Cheng-Ming Sun, thèsard

Edith Dériaud, CNRS

Catherine Fayolle, IP

Marie Rojas, IP


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