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  Responsable : BABINET Charles (chbabi@pasteur.fr)


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Notre laboratoire s'intéresse au développement embryonnaire de la souris. Trois voies de recherche sont poursuivies : 1) Le rôle des interactions nucléocytoplasmiques dans le développement préimplantatoire. 2) L'analyse de la fonction de certains gènes par mutagenèse dirigée in vivo et la recherche de gènes de développement grâce à la stratégie de piégeage de gènes dans les cellules ES. 3) La mise au point de stratégies plus efficaces de mutagenèse par recombinaison homologue (RH).



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1. Clonage de la mutation Ovum mutant, entraînant la mort embryonnaire au stade blastocyste et dont l'expression dépend d'un effet parental (P. Baldacci, M. Cohen-Tannoudji)

La lignée DDK est porteuse d'une mutation létale conditionnelle, Ovum mutant, qui entraîne la mort des embryons au stade blastocyste et dépend d'un effet parental. Nous avons maintenant établi un contig complet de la région génétique contenant le locus Om à l'aide de chromosomes artificiels de levure et de bactéries. Les techniques de piégeage d'exons et d'hybridation/sélection de cDNA associés au séquençage de la région Om (collaboration avec le Centre National de Séquençage, Evry) nous ont permis d'identifier environ une cinquantaine de gènes. Parmi ceux-ci, deux sont exprimés dans l'oocyte et le testicule et présentent des différences de séquences dans la région codante, uniques à la lignée DDK. Nous mettons en oeuvre des techniques d'analyse fonctionnelle pour démontrer de manière directe leur implication dans la létalité embryonnaire.

2. Analyse de la fonction des gènes par mutagenèse dirigée in vivo et recherche de gènes impliqués dans le développement par piégeage de gènes

Mutations nulles dans des gènes codant pour des protéines de la famille des filaments intermédiaires (E. Colucci-Guyon)

Cette année, nous avons cherché à éprouver l'hypothèse d'une implication de la vimentine dans la formation de certaines tumeurs. Pour cela nous avons utilisé le système des tératocarcinomes et montré à l'aide des cellules ES Vim -/- et sauvages implantées ectopiquement soit dans des souris sauvages soit dans des souris Vim -/- que la formation de tératocarcinomes était indépendante de la présence d'un réseau de vimentine. Par ailleurs, nous avons créé des souris knock-out pour les cytokératines K6 et montré en collaboration avec le groupe du Dr. P. Coulombe (John Hopkins, Baltimore) que celles-ci jouaient un rôle structural essentiel dans la muqueuse orale.

Mutations nulles dans les gènes SNF5/INI1 et v HNF1 (J. Barra en collaboration avec le laboratoire de M. Yaniv, Institut Pasteur)

Nous avons créé des allèles nuls de ces deux gènes (par RH dans les cellules ES) et le phénotype engendré par la mutation nulle à l'état homozygote a été analysé. Dans le cas de SW1/SNF5, nous avons montré que les embryons SW1/SNF5 meurent aux alentours de l'implantation et donc que le produit de ce gène était indispensable au développement précoce de l'embryon. En outre, les souris hétérozygotes pour la mutation développent des tumeurs à haute fréquence, suggérant un rôle de gène suppresseur de tumeur pour SW1/SNF5.
Nous avions montré que des embryons homozygotes pour une mutation nulle du gène v HNF1 meurent aux alentours du jour 7 de la gestation et qu'un défaut de différenciation de l'endoderme viscéral en était la cause primaire. Nous avons cette année abordé le rôle de vHNF1 dans l'organogénèse, par mutagénèse conditionnelle. Des résultats préliminaires obtenus après délétion du gène dans l'épiblaste suggèrent un blocage très précoce dans le développement du rein ainsi que des anomalies dans la formation du foie et du pancréas.


Piégeage de gènes dans les cellules ES (J. Barra)

Cette approche a pour but la création de mutations dans des gènes actifs au cours du développement de l'embryon de souris, en vue de leur caractérisation et de l'étude de leur fonction. Ces mutations sont obtenues par l'insertion, dans le génome des cellules ES, d'un vecteur qui comprend un gène rapporteur (qui code la beta-galactosidase et une protéine de résistance à un antibiotique), dépourvu de promoteur et de séquences régulatrices. Ce rapporteur ne s'exprime donc que s'il est inséré en phase dans un gène actif dans les cellules ES. Nous avons poursuivi cette année l'analyse de deux mutations d'insertion, l'une dans le gène SSeCKS, qui code pour une protéine d'ancrage des kinases A et C, l'autre dans le gène TRAPa, qui code pour une sous-unité d'un complexe protéique associé au translocon. Dans le premier cas, l'analyse moléculaire de l'insertion dans le gène SSeCKS nous a permis de montrer que ce gène codait pour deux protéines dont l'une était une forme tronquée de l'autre. La forme la plus longue a un large patron d'expression en particulier dans le système nerveux, la forme tronquée est spécifique de la lignée germinale mâle. De plus, seule la première est invalidée par l'insertion. De manière surprenante, les souris homozygotes pour l'insertion ne présentent pas de phénotype évident. Cependant, compte tenu de l'importance postulée pour les voies de transduction du signal par la PKA dans les processus d'apprentissage et de mémoire, il est possible que ces souris présentent un défaut dans ces derniers. L'insertion dans le gène TRAPa, elle, entraîne une létalité embryonnaire vers le jour 14 de développement et des résultats préliminaires suggèrent que les embryons souffrent d'un défaut de morphogènèse du coeur.


3. Une approche en vue d'améliorer l'efficacité du ciblage génique (M. Cohen-Tannoudji)

Nous avons récemment mis au point une stratégie de modification du génome de la souris basée sur la stimulation des processus endogènes de réparation qui permet d'augmenter considérablement la fréquence de mutation par ciblage de gène dans un locus donné. Sur la base de cette stratégie, nous cherchons à: i) perfectionner les méthodes de mutagenèse dirigée en introduisant des modifications programmées directement dans le génome du zygote sans passer par les cellules souches embryonnaires de souris. ii) réaliser des modifications génétiques ciblées dans des cellules somatiques grâce à cette méthodologie. iii) identifier un ou plusieurs sites permissifs pour l'expression ciblée de gènes impliqués dans le développement d'une pathologie ou d'agents thérapeutiques dans le cadre d'études de faisabilité de thérapie génique.

Dernièrement, nous avons développé un gène rapporteur test, constitué de deux fragments du gène lacZ, interrompu par un site I-SceI. Le gène rapporteur n'est pas fonctionnel car il existe une région dupliquée de part et d'autre du site I-SceI. Un événement de recombinaison intramoléculaire sera induit par l'action de l'enzyme sur son site de reconnaissance spécifique et permettra alors de rétablir un gène rapporteur fonctionnel dont l'activité pourra être révélée aisément.
Nous avons placé ce gène rapporteur test sous le contrôle de plusieurs promoteurs. Les constructions correspondantes ont été transférées dans des cellules en culture et chez l'animal. Ces souris transgéniques permettront en particulier de tester la faisabilité de l'approche de recombinaison homologue in ovo.

Activité de service(V. Guyot)

L'unité a la responsabilité d'un service pour la création de souris transgéniques.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

FLEURANCE Isabelle

BABINET Charles, CNRS et IP, chbabi@pasteur.fr

BALDACCI Patricia, IP, baldacci@pasteur.fr

BARRA Jacqueline, IP, barraja@pasteur.fr

COHEN-TANNOUDJI Michel, CNRS, m-cohen@pasteur.fr

COLUCCI-GUYON Emma, IP, emmaco@pasteur.fr

COUMAILLEAU Franck, Doctorant

LE BRAS Stéphanie, Doctorante

PEYRON Fabienne, équivalent à Ingénieur d'étude

KRESS Chantal, CNRS

MESBAH Karim, IP

VANDORMAEL-POURNIN Sandrine, IP


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