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  Responsable : GOLDBERG Michel (goldberg@pasteur.fr )


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L'Unité combine la physico-chimie, la biochimie, la génétique, l'ingénierie et la modélisation des protéines pour étudier divers problèmes liés à leur structure et à leur intégration dans plusieurs fonctions cellulaires: l'acquisition de leur structure fonctionnelle in vitro et in vivo, les aspects énergétiques de leurs interactions, l'origine atomique de leur stabilité et de leur spécificité fonctionnelle, l'utilisation comme agents vaccinants de protéines modifiées par "greffage" de peptides artificiels et l'utilisation de protéines modifiées dans diverses applications biotechnologiques.



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REPLIEMENT DES PROTÉINES IN VITRO (Michel Goldberg)

Ces recherches portent sur la connaissance, au niveau fondamental, des mécanismes qui permettent à une protéine d'acquérir en quelques secondes la structure tridimensionnelle complexe, dite "native", qui lui confère ses propriétés biologiques. Les connaissances ainsi acquises sont utilisées pour améliorer la
structuration de protéines, en particulier dans des processus industriels liés aux biotechnologies.


a- Etude des intermédiaires précoces de repliement (Michel Goldberg - Valérie Guez - Alain Chaffotte)

Nous avons poursuivi l'étude du couplage entre la formation d'interactions à longue portée (les ponts disulfures) et l'apparition de structures locales (les alpha-hélices et les brins beta de la structure secondaire) lors des étapes précoces du repliement d'une protéine modèle particulièrement bien adaptée, le lysozyme de poule. Partant de l'observation que la structure secondaire du lysozyme se forme très rapidement lorsque les 4 ponts disulfures sont préformés, alors qu'elle n'apparaît pas en leur absence, nous avons cherché à identifier ceux des ponts disulfures qui sont essentiels à la formation très rapide de la structure secondaire. Pour cela, nous avions construit au cours des années précédentes 4 doubles mutants dans chacun desquels les 2 cystéines engagées dans l'un des 4 ponts S-S avaient été remplacées par 2 alanines.

L'effet de la suppression d'un pont S-S dans trois protéines, 2 mutantes et la protéine naturelle partiellement réduite, a désormais été caractérisé par une série de critères spectroscopiques, hydrodynamiques et fonctionnels qui ont permis de confirmer la très grande similarité structurale des protéines "naturelle" (avec 4 ponts disulfures) et "mutante" (avec 3 ponts disulfures). Les différentes phases de leur repliement ont été étudiées en utilisant un mélangeur rapide qui permet de déclencher le repliement en moins de 4 millièmes de secondes. Nous avons ainsi pu démontrer que la suppression du pont disulfure entre les aminoacides n° 30 et 115, comme de celui entre les aminoacides n° 6 et 127, n'empêche pas la formation de la structure secondaire, qui se produit comme dans la protéine naturelle en un temps très court (moins de 4 millisecondes). Par contre, la suppression de l'un ou de l'autre de ces ponts disulfures accélère la renaturation de ces deux mutants car elle empêche la formation d'une espèce partiellement structurée qui ralentit le repliement de la protéine naturelle. La suppression du pont disulfure entre les aminoacides 76 et 94 n'empêche pas non plus la formation de la structure secondaire "native" en moins de 4 millisecondes. Parcontre, l'intermédiaire partiellement structuré peut encore se former, ce qui ralentit fortement le repliement de ce mutant. Ces observations constituent un ensemble de preuves expérimentales solides en faveur du modèle du "paysage énergétique" récemment proposé par les théoriciens pour expliquer le repliement rapide des protéines.


b- Production et étude d'une protéine recombinante, candidat vaccin contre le paludisme(Alain Chaffotte)

Les travaux de Shirley Longacre (Unité de Biologie des Interactions Hôte-Parasite) ont montré qu'un fragment peptidique d'une centaine de résidus correspondant à l'extrêmité C-terminale d'une protéine membranaire du plasmodium était un bon candidat vaccin contre le paludisme. Ces études ont été initialement réalisées sur P. cinomolgi, peu pathogène pour l'homme. La structure tridimensionnelle de ce fragment a été résolue dans l'Unité d'Immunologie Structurale. Pour transposer ces résultats à la vaccination humaine, il est important de produire et de caractériser le fragment peptidique équivalent isolé de P. falciparum, véritable fléau responsable de la maladie humaine. Des essais ont été réalisés pour produire ce fragment en quantité et à bas coût à partir de bactéries recombinantes. Cependant, la protéine produite à l'intérieur des bactéries n'a pas formé les 6 ponts disulfures indispensables à sa structure et à son pouvoir vaccinant.

Dans l'Unité, des essais préliminaires d'oxydation de la protéine réduite ont montré qu'il était difficile d'obtenir la protéine native correctement oxydée. Nous avons donc cherché à exprimer le fragment C-terminal de la protéine de P. falciparum dans des conditions où l'oxydation naturelle de ponts disulfures est favorisée. Des conditions où l'une des constructions génétiques étudiées est produite en quantité appréciable ont été trouvées. L'état d'oxydation et l'antigénicité de la protéine ainsi exprimée sont en cours d'étude.


c- Cinétique d'association-dissociation et de repliement de la DHFR R67 (Annick Méjean)

Notre étude sur les aspects cinétiques de l'équilibre dimères-tétramères au sein de la DHFR R67, et plus particulièrement du mécanisme par lequel le pH contrôle cet équilibre, a été achevée cette année et a permis de confirmer que l'évènement qui déclenche la dissociation du tétramère est sa protonation. Au contraire, c'est la dé-protonation du dimère qui provoque son association. Un modèle original permettant de rendre compte quantitativement de ces observations a été élaboré. Il utilise en particulier les propriétés de mutants de la DHFR produits dans le cadre des travaux de modélisation décrits ci-dessus. Dans le but d'identifier les évènements moléculaires responsables de l'initiation du repliement de la DHFR R67, nous cherchons à savoir si l'assemblage de deux monomères désordonnés précède le repliement des monomères, ou si au contraire les monomères doivent d'abord se replier pour pouvoir se reconnaître et s'assembler en dimères. Pour cela, nous avons abordé l'étude de la cinétique de renaturation de la DHFR R67 à pH 5, où elle se renature sous forme de dimères stables. En observant les cinétiques de regain des propriétés spectrales de la protéine (dichroïsme circulaire dans l'ultra-violet lointain, fluorescence de la protéine), nous avons pu identifier trois phases. L'une, extrêmement rapide, est achevée en moins de 4 millisecondes. Une deuxième, rapide, a une demi-vie de l'ordre d'une demi-seconde. La dernière, beaucoup plus lente, a une demi-vie de l'ordre de 30 secondes. Nous avons pu montrer que la phase lente est accélérée par la présence d'une prolyl-isomérase, et qu'elle correspond donc à l'isomérisation cis-trans d'une proline. Nous cherchons actuellement à identifier celle de ces phases qui correspond à l'assemblage des sous-unités en dimères.


II- MODÉLISATION MOLÉCULAIRE DE L 'ÉNERGIE D 'ASSOCIATION ENTRE PROTÉINESArnaud Blondel)

Les activités de ce groupe sont axées sur l'étude expérimentale et théorique des associations entre macromolécules biologiques avec les motivations suivantes:

- Proposer des méthodes précises et rapides de modélisation des énergies d'interaction entre protéines suffisamment fiables pour que les résultats de ces modélisations permettent de s'affranchir de certaines expériences intermédiaires dans le développement des sciences biologiques. En particulier, la modélisation est de plus en plus utilisée dans la conception de nouveaux agents thérapeutiques. L'amélioration et la fiabilisation des méthodes de modélisation des associations impliquées dans divers processus biologiques est donc un enjeu très important.

- Atteindre une connaissance fine et juste de la physique des biomolécules sur laquelle fonder ces méthodes de modélisation pour leur permettre d'être aussi générales que possible. L'étude systématique des associations entre macromolécules biologiques permet de tester quantitativement cette connaissance. Il y a là de nouveau un enjeu très important, car l'appel sans précédent de traitements et de prédictions bioinformatiques de l'aire post-génomique ne pourra être pleinement satisfait sans une telle connaissance.

L'étude de l'énergie des associations protéine-protéine a été choisie car elles peuvent être à la fois:
. caractérisées par des mesures expérimentales directes,
. modélisées par un formalisme théorique rigoureux.
Les méthodes théoriques de prédiction peuvent ainsi être testées avec rigueur. Toujours dans un souci de rigueur, le groupe a développé ses propres outils expérimentaux de sorte que les processus moléculaires que l'on tente de modéliser soient bien définis mécanistiquement, et caractérisés avec une grande précision.

Ainsi, nos travaux sont réalisés sur une protéine, la dihydrofolate réductase DHFR R67, responsable de la résistance de certaines bactéries à un antibiotique, formée par l'association de 4 sous-unités identiques. Des variants de cette protéine permettant de sonder l'importance des différents contacts de l'association ont été construits par génie génétique. L'association entre variants a été mise en évidence par un système de tests combinatoires développé au laboratoire. Ces associations ont alors été caractérisées, sur le plan énergétique, par des méthodes physico-chimiques très précises également mises au point au laboratoire. Enfin, afin de contrôler l'effet structural des modifications apportées à la protéine, nous avons cristallisé un certain nombre de variants sous forme isolée ou associée et entrepris le raffinement cristallographique de la structure atomique de ces molécules.

Parallèlement, afin de tester les méthodes théoriques, les énergies mises en jeu dans ces associations sont calculées par modélisation. Pour cela, une méthode de calcul des variations d'énergie libre permettant de réduire très significativement les incertitudes des calculs a été conçue et développée au laboratoire. Cette méthode a été étendue pour tenir compte des molécules d'eau entourant les protéines ainsi que des interactions électrostatiques à longue distance (voir figure). Elle a été incorporée dans la version académique du programme informatique, CHARMM. L'implémentation en a été faite au laboratoire pour pouvoir utiliser des stations de travail Unix et des super-calculateurs massivement parallèles.

L'année 2000 nous a apporté des résultats qui complètent ceux des années précédentes:

- Sur le plan expérimental, le mécanisme des associations a été étudié grâce à des mesures de cinétiques et à l'équilibre. Ceci a permis de développer un modèle mathématique de l'ensemble des réactions en jeu et ainsi de déterminer l'affinité des complexes. La robustesse de ce modèle mathématique a été démontrée pour tous les exemples auxquels il a été appliqué. Ainsi les effets de 15 types de modifications entre 6 types de complexes sont maintenant connus pour un mécanisme d'association bien précis. Des cristaux ont été obtenus pour plusieurs variants et selon le cas pour des formes associées ou dissociées. Le raffinement cristallographique préliminaire montre peu de changement structural dans les tetramères par rapport à la protéine sauvage.

- Sur le plan de la modélisation, plusieurs séries de calculs ont été effectuées. Elles ont permis de montrer qu'il est essentiel de bien prendre en compte les relaxations structurales consécutives aux mutations pour la précision des calculs. Un protocole de calcul a été mis au point pour cela. Par ailleurs, en effectuant des calculs redondants, nous avons pu montrer que notre méthode avait de bonnes propriétés de convergence (~0.4 kcal/mol par calcul). Enfin, l'accord avec les données expérimentales est bon (~0.4 kcal/mol de différence moyenne). La validation de la méthode est poursuivie sur d'autres types d'associations.


Il nous paraît important de préciser qu'une série de calculs prend à ce jour de l'ordre de 2 mois sur station de travail, mais que sur les super-calculateurs de demain ( > 1 Tflops), ces mêmes calculs ne devraient prendre que 2-3 jours, c'est-à-dire bien moins que le temps requis pour obtenir le résultat par une approche expérimentale...

Les acquis du travail de ces dernières années, concrétisés au cours de l'année écoulée, sont les suivants:

- Un système d'exploration combinatoire des interactions protéine-protéine.

- Une nouvelle méthode de mesure des associations entre hétérodimères.

- Un jeu de données expérimentales précises permettant de tester les prédictions d'interactions protéine-protéine.

- Une nouvelle approche des calculs d'énergie libre en dynamique moléculaire permettant de réduire significativement les incertitudes de calcul tout en prenant en compte les molécules d'eau et les interactions électrostatiques à longue distance.

- Un protocole de calcul d'énergie libre tenant compte des relaxations structurales.

Les résultats de cette année permettent de tirer deux conclusions importantes:

- Il semble désormais possible de prédire par modélisation, avec une précision comparable aux expériences, l'effet de mutations sur l'assemblage de protéines.

- Dans la mesure des calculs effectués, les champs de forces et méthodes de modélisation utilisés dans le programme CHARMM permettent de bien rendre compte de la physique des macromolécules biologiques, et semblent donc applicables à d'autres problèmes de modélisation.


III- CONTRÔLE DU REPLIEMENT DES PROTÉINES DE L 'ENVELOPPE BACTÉRIENNE(Jean-Michel Betton - Nathalie Sassoon - Jean-Philippe Arié - Sabine Hunke - Mireille Hervé)

La compartimentation cellulaire des bactéries Gram-négatives implique des mécanismes spécialisés dans le contrôle de qualité du repliement des protéines de l 'enveloppe permettant de (i) détecter la présence de protéines incorrectement repliées dans ce compartiment et de (ii) transduire cette information à travers la membrane interne. Ces mécanismes de contrôle sont intimement liés aux systèmes qui permettent la réponse aux stress extra-cytoplasmiques. Cette réponse est régulée par deux systèmes distincts, la voie Cpx (système à deux composants où CpxA est une protéine kinase qui joue le rôle de senseur et CpxR d'activateur transcriptionnel) et la voie de régulation du facteur de transcription sigmaE (où RseA agit comme un anti-facteur sigmaE). La nature exacte des stimuli capables d'induire spécifiquement ces deux voies de signalisation est loin d'être établie, mais quels qu 'ils soient, ces deux systèmes activent l'expression, entre autres, des gènes de choc thermique fkpA ou degP/htrA qui codent respectivement pour une peptidyl-prolyl isomérase ou PPIase (enzyme qui catalyse l'isomérisation cis/trans des liaisons peptidiques impliquant un résidu proline) et pour une protéase à sérine dégradant les protéines d 'enveloppe incorrectement repliées. Par ailleurs ces deux protéines sont impliquées dans la virulence de nombreuses bactéries pathogènes.

Afin de comprendre les mécanismes de reconnaissance et de régulation cellulaires liés à la présence de protéines d'enveloppe anormales, nous utilisons l'expression d'un mutant d'une protéine périplasmique modèle, la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées qui s'agrègent et forment des granules protéiques (corps d'inclusion) incluses dans le périplasme. Nous examinons les effets de l'inactivation des gènes degP et fkpA sur l'induction des deux voies de signalisation en utilisant l'activité promotrice du gène degP (à l'aide d'une fusion transcriptionnelle degP/htrA-lacZ) et l'analyse biochimique des protéines d'enveloppe qui sont distribuées entre les fractions soluble/exportée (extrait périplamsique) et insoluble (extrait membranaire), préparées à partir de sphéroplastes. Cette technique, que nous avons mise au point, permet de quantifier la partition cinétique entre les voies productives (vers la structure native) et les voies non productives (vers l'agrégation) qui existe au cours du repliement cellulaire des protéines. L'effet de la température sur la croissance des bactéries surexprimant malE31 est activement étudié car nous avons observé que si aucun phénomène d'interférence ou d'inhibition de l'exportation, lié à la surproduction de ce variant, n'était détecté à 30°C, un phénotype thermo-sensible (et léthal) pouvait s'observer à 37°C, mais pas à 42°C. D'autre part, nous étudions les relations structure-fonction des deux protéines de choc thermique FkpA et DegP qui contrôlent le repliement et l'assemblage des protéines de l'enveloppe. Pour FkpA, nous venons de mettre en évidence que son activité chaperon, indépendante de son activité PPIase, est capable de prévenir l'agrégation périplasmique de MalE31. Pour DegP, nous étudions son organisation structurale afin de comprendre les mécanismes qui lui permettent la reconnaissance spécifique des protéines incorrectement repliées. Pour cela, nous cherchons à déterminer le rôle respectif des deux domaines PDZ, qui forment la partie C-terminale de la protéase, dans les processus d'assemblage fonctionnel et de fixation des substrats.

Enfin, nous avons participé à l'évaluation d'un système de production de protéines in vitro, basé sur le couplage transcription-traduction à haut rendement, qui est commercialisé par la société Roche Diagnostic sur le nom de Rapid Translation System (RTS500). En collaboration avec le laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules (Département BGM), nous avons testé la possibilité de marquer sélectivement les protéines produites dans le système RTS par des acides aminés enrichis en carbone 13 et azote 15. Ce type de marquage spécifique, qui est essentiel pour la préparation d'échantillons pour la spectroscopie RMN, est pratiquement impossible à réaliser dans la bactérie à cause du métabolisme des acides aminés. Nos résultats, obtenus à partir d'une protéine modèle, la protéine affine du maltose (MalE), et de deux acides aminés, l'acide aspartique et l'arginine, représentatifs du métabolisme bactérien, montrent que tous les résidus Asp et Arg ont été quantitativement marqués sans redistribution des atomes lourds au niveau des autres résidus de la protéine. Ce résultat préliminaire suggère que le métabolisme des acides aminés n'est pas fonctionnel dans le système in vitro.


IV- Ingénierie des protéines (URL www.pasteur.fr//units/bcel/peng) (Hugues Bedouelle)

Nos recherches sont focalisées sur les relations entre la structure tri-dimensionnelle des protéines, leur stabilité conformationnelle et leur mécanisme d'action. Nous utilisons l'approche multidisciplinaire de l'ingénierie des protéines, y compris l'évolution dirigée in vitro. Durant l'année 2000, nous avons terminé nos travaux sur les relations entre la dynamique conformationnelle et la fonction de deux enzymes bactériennes, la tyrosyl-ARNt synthétase et la tryptophane synthase, poursuivi nos travaux sur la transformation d'anticorps en immuno-capteurs optique autonomes, et étudié les mécanismes de reconnaissance entre un anticorps protecteur et différents sérotypes du virus de la dengue.


a- Construction de biocapteurs à partir d 'anticorps (Martial Renard - Laurent Belkadi - Patrick England - Hugues Bedouelle)

Un biocapteur comprend deux composants majeurs: un récepteur biologique, qui reconnaît spécifiquement un ligand, et un transducteur, qui détecte l'évènement de reconnaissance et le transforme en un signal mesurable. Les anticorps monoclonaux semblent idéaux pour fournir le récepteur biologique des biocapteurs, puisqu'ils peuvent être dirigés contre la plupart des haptènes et des macromolécules. Nous développons un ensemble d'approches pour transformer les anticorps en biocapteurs optiques autonomes. Nous avons choisi l'anticorps monoclonal mAbD1.3, dirigé contre le lysozyme de poule, comme système expérimental car des données structurales détaillées sont disponibles. Ces approches seront étendues à des anticorps pour lesquels les données structurales n'existent pas, puis à d'autres types de récepteurs. Ces biocapteurs pourraient avoir de nombreuses applications en diagnostic, en pharmacologie et dans l'industrie, en particulier sous forme de puces à protéines.


b- Bases structurales des réactions immunitaires croisées (Laurent Belkadi - Patrick England - Hugues Bedouelle)

La plupart des virus possèdent plusieurs sérotypes, qui peuvent être distingués au moyen d'anticorps spécifiques. Inversement, certains anticorps monoclonaux peuvent reconnaître plusieurs sérotypes. Nous avons analysé ce phénomène pour un anticorps monoclonal qui est dirigé contre le virus de la dengue et reconnaît ses 4 sérotypes avec des efficacités variables. Chaque résidu des boucles hypervariables CDR3 de l'anticorps a été changé en alanine. Les variations d'affinité pour les protéines d'enveloppe des sérotypes DEN1 et DEN2 du virus, et les vitesses d'interaction correspondantes ont été mesurées par ELISA de compétition et BIAcore. Les résidus de l'anticorps qui intervenaient dans la reconnaissance du sérotype DEN2, constituaient un sous-ensemble de ceux pour DEN1, et leurs contributions énergétiques étaient plus faibles. Néanmoins, les résidus prépondérants pour la reconnaissance de l'antigène étaient les mêmes pour les deux sérotypes. Certaines délétions de chaînes latérales amélioraient la reconnaissance du sérotype DEN2 sans affecter celle de DEN1. Ces résultats devraient aider à modifier l 'anticorps pour qu 'il reconnaisse les différents sérotypes avec la même affinité, dans un but thérapeutique.


c- Structure modulaire de la tyrosyl-ARNt synthétase (Valérie Guez - Carole Gaillard - Hugues Bedouelle; en collaboration avec l 'Unité de RMN des Biomolécules)

Beaucoup de protéines naturelles ont été formées par l'assemblage de modules ou de domaines, et cette observation a inspiré de nombreuses approches en ingénierie des protéines. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) est un homodimère. Chaque sous-unité comprend trois domaines structuraux: un domaine N-terminal (résidus 1-220 chez Bacillus stearothermophilus) qui possède le repliement caractéristique des aminoacyl-ARNt synthétases de classe I, un domaine alpha-hélical de fonction inconnue, et un domaine C- terminal (résidus 320-419) qui fixe l'anticodon de l'ARNt et qui est désordonné dans la structure cristalline.

Nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine C-terminal de la TyrRS issue de B. stearothermophilus, en collaboration avec l'Unité de RMN. Cette structure appartient à la super-famille de la protéine ribosomale S4 mais elle est nouvelle parmi les aminoacyl-ARNt synthétases. Ainsi, la TyrRS et d'autres protéines ont recruté le même domaine pour fixer leur ligand d'ARN. Nous avons effectué une exploration du peptide qui lie le domaine alpha-hélical et le domaine C-terminal de la TyrRS, par mutagenèse. Nous avons trouvé que le résidu conservé Phe323 et la séquence amont étaient importants pour le chargement du tRNATyr mais pas la séquence aval, qui pouvait être rendue flexible. Le caractère aromatique de Phe323 était important pour la stabilité du complexe initial entre la TyrRS et tRNATyr, et plus encore pour la stabilité de leur complexe dans l'état de transition. Ces résultats ont indiqué que Phe323 appartient au domaine alpha-hélical de la TyrRS, et que la reconnaissance du bras anticodon du tRNATyr fait intervenir des résidus de ses deux domaines idiosynchratiques (alpha-hélical et C-terminal).


d- Allostérie et canalisation du substrat chez la tryptophane synthase (Philippe Rondard — Hugues Bedouelle)

La tryptophane synthase d'Escherichia coli est une enzyme tétramérique, avec une structure de type TrpA.TrpB.TrpB.TrpA. Des études structurales ont identifié les résidus 273-283 de TrpB comme une région potentiellement importante pour la communication allostérique entre les sous-unités TrpA et TrpB, et pour le transport de l'indole entre leurs sites actifs au travers d'un tunnel hydrophobe. Nous avons construit 19 mutations des résidus 273-283 de TrpB pour explorer le rôle fonctionnel de cette région. Les mutations ont pu être divisées en 4 classes suivant leurs effets sur les activités tryptophane synthase et sérine déaminase du dimère de TrpB2, mesurées soit en présence soit en absence de la sous-unité TrpA. Nous avons confirmé le rôle allostérique des résidus 278-282 de TrpB, et nous avons décrit les étapes réactionnelles et les contacts intramoléculaires qui pourraient être affectés par chaque classe de mutations.


V- Toxines recombinantes d'intérêts thérapeutiques ou biotechnologiques (Daniel Ladant - Agnès Ullmann)

Dans notre équipe, nous étudions depuis plusieurs années, la toxine adénylcyclase (AC) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Cette toxine est l'un des facteurs de virulence essentiels de cet organisme : elle est sécrétée par B. pertussis et possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activée par la calmoduline, elle synthétise activement de l'AMP cyclique et altère ainsi le métabolisme cellulaire.

L'adénylcyclase est un polypeptide de 1706 acides aminés, qui présente plusieurs propriétés remarquables d'un point de vue fondamental. Cette toxine possède en particulier la propriété tout à fait originale de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers la membrane plasmique de ces cellules.

Les travaux de l 'équipe au cours de l 'année ont porté essentiellement sur trois aspects :


a- Analyse des relations structure/fonction de la toxine (Cécile Bauche — Daniel Ladant)

Ces travaux réalisés en étroite collaboration avec l 'équipe de C. Leclerc (Biologie des Régulations Immunitaires, Institut Pasteur) ont une composante fondamentale, qui concerne l 'étude des mécanismes moléculaires responsables de la translocation de la toxine AC dans les cellules cibles, et une composante appliquée, focalisée sur l'ingénierie de toxines AC recombinantes d 'intérêt vaccinal. Nous avons montré en effet que la toxine AC est capable de vectoriser des épitopes T CD8+ (c 'est-à-dire associés aux complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I, CMH-I) dans les cellules présentatrices d 'antigènes afin d 'activer des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques. Le résultat le plus important obtenu en 2000, concerne l 'identification du récepteur cellulaire de la toxine AC : il s 'agit de la molécule CD11b une sous-unité de l 'intégrine alphaM/beta2 présente à la surface d 'une population restreinte de leukocytes, dont les cellules dendritiques. Le ciblage sélectif de la toxine AC sur les cellules dendritiques explique vraisemblablement le remarquable pouvoir immunogène des toxines AC recombinantes. D 'autre part, nous avons produit et caractérisé différentes toxines recombinantes portant des épitopes T caractéristiques de cellules tumorales humaines (mélanomes en particulier) qui sont en cours d 'étude pour tester leur capacité à stimuler des réponses immunes.


b- Développement d'un "système double hybride bactérien" (Gouzel Karimova - Agnès Ullmann - Daniel Ladant)

Ce système permet de détecter in vivo, chez Escherichia coli, par des tests phénotypiques simples, des interactions protéine-protéine. Il est fondé sur la complémentation fonctionnelle de deux fragments du domaine catalytique de l 'AC, fusionnés aux protéines d'intérêts. Dans une souche d'E.coli cya, l'association des deux protéines hybrides restaure l'activité enzymatique adénylcyclase, donnant lieu à une synthèse d 'AMPc qui active les opérons cataboliques. Cette cascade d'activation est détectable par criblage sur des milieux indicateurs ou sélectifs. Cette méthodologie est particulièrement appropriée pour l 'étude des relations structure/fonction des macromolécules biologiques ainsi que pour l 'ingénierie de nouveaux catalyseurs et d 'outils de diagnostique (anticorps monoclonaux). Nos travaux récents ont été consacrés à l'amélioration de ce test génétique ainsi qu 'à son application à l 'étude des associations protéine-protéine dans un système de transduction de signal bactérien à deux composants (BvgA/BvgS).


c- Elaboration d 'un système génétique de détection d 'activité protéolytique site-spécifique chez E. coli (Nathalie Dautin — Gouzel Karimova — Agnès Ullmann — Daniel Ladant)

Ce crible génétique, qui permet d 'analyser chez E. coli des activités protéolytiques avec une très grande sensibilité, est fondé sur l'inactivation, par protéolyse spécifique, de l 'AC modifiée par insertion d'un polypeptide correspondant au site de clivage de la protéase d'intérêt. Dans une souche E. coli cya, l 'inactivation de l 'AC reflète l 'activité protéolytique in vivo, ce qui peut être visualisée aisément sur des milieux indicateurs et/ou sélectifs et quantifiée en mesurant l'AMPc et/ou l'activité beta-galactosidase. Nous avons démontré les possibilités de cette approche en utilisant comme modèle, la protéase du virus de l 'immunodéficience humaine (VIH). Nous avons montré en particulier que ce test est capable de détecter des protéases du VIH résistantes aux drogues antiprotéase. Notre objectif à court terme est de développer un test de diagnostic phénotypique de la résistance du VIH aux antiprotéases. Les inhibiteurs de la protéase VIH sont des agents anti-viraux très puissants dont l 'efficacité malheureusement est limitée par l 'extraordinaire capacité d 'adaptation du virus. La détection précoce de l 'émergence des variants viraux résistants pourrait permettre d 'adapter au mieux les traitements des patients atteints du SIDA.


VI- Apport des méthodes physicochimiques de l'Unité à diverses collaborations (Alain Chaffotte - Michel Goldberg - Roland Nageotte)

Comme c'est le cas depuis de nombreuses années, l'Unité met au service de la collectivité scientifique, en particulier pasteurienne, son équipement et ses compétences dans l'étude physicochimique des protéines en solution et de leurs interactions. Elle participe à la conception d'expériences d'ultracentrifugation analytique, de spectroscopie de fluorescence, de dichroïsme circulaire, et de cinétiques rapides, réalise les expériences correspondantes et les interprète au bénéfice des équipes qui les sollicitent.

Comme exemple de ces nombreuses collaborations, l'étude par dichroïsme circulaire réalisée pour V. Redeker (Laboratoire de Neurobiologie et Diversité Cellulaire de l'Ecole Supérieure de Physique et Chimie Industrielles) de 5 peptides synthétiques actifs, de séquences apparentées à celles de toxines de fourmis venimeuses, a montré que contrairement aux prédictions structurales, ils sont désorganisés en solution aqueuse, mais possèdent une forte propension à adopter une conformation alpha-hélicale en présence de faibles quantités de trifluoroéthanol.


VII- ENSEIGNEMENT

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (Directeur A. Chaffotte) associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et une partie importante de ce cours est réalisée par le personnel de l'Unité. En particulier, deux groupes de l'Unité (Repliement des protéines in vitro et Repliement des protéines dans l'enveloppe bactérienne) ont organisé chacun 2 semaines complètes de travaux pratiques dans le cadre de ce cours en 2000.
Deux étudiants de DEA et quatre thésards étaient en formation dans l 'Unité en 2000.


Légendes des photos :

Calcul de l'effet de mutations sur la constante d'association de la DHFR R67.
a: vue générale, les structures secondaires sont schématisées et colorées respectivement en rouge, bleu, vert et jaune pour les quatre sous-unités de la protéine. Les atomes des résidus modifiés sont représentés par des sphères, oranges pour les atomes que l'on fait disparaître et noires pour les atomes que l'on fait apparaître. Les liaisons O-H de l'eau sont représentées en bleu.
b: vue rapprochée des résidus modifiés correspondant à la partie supérieure de la vue générale. Les sous-unités bleue et rouge sont représentées par type de structures secondaires et par les liaisons covalentes. Les résidus que l'on fait disparaître sont représentés en couleur CPK, carbones bleu-clair, bâtons fins; ceux que l'on fait apparaître sont représentés en couleur CPK, carbones vert-foncé, bâtons épais. Les résidus symétriques inchangés sont représentés par des sphères et bâtons. Les atomes de l'environement des résidus modifiés sont représentés par la surface qu'ils créent en blanc transparent. Enfin les liaisons O-H de l'eau sont représentées par des traits fins bleus.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LENOIR Lucile, llenoir@pasteur.fr

BEDOUELLE Hugues, Directeur de Recherche 2 CNRS : hbedouel@pasteur.fr

BETTON Jean-Michel, Directeur de Recherche 2 CNRS : jmbetton@pasteur.fr

BLONDEL Arnaud, Assistant IP : ablondel@pasteur.fr

CHAFFOTTE Alain-François, Chef de Laboratoire IP : chaffott@pasteur.fr

ENGLAND Patrick, Chargé de Recherche IP : england@pasteur.fr GOLDBERG Michel, Professeur IP : goldberg@pasteur.fr

GUEZ Valérie, Assistant IP : vguez@pasteur.fr

KARIMOVA Gouzel, Chargé de Recherche IP : karimova@pasteur.fr

LADANT Daniel, Directeur de Recherche IP : ladant@pasteur.fr

MEJEAN Annick, Maître de Conférences 2 UP7 : amejean@pasteur.fr

ARIE Jean-Philippe, Doctorant UP11 : jparie@pasteur.fr

BAUCHE Cécile, Post-doct. française : bauche@pasteur.fr

BODENREIDER Christophe, Doctorant UP7 : cboden@pasteur.fr

DAM Julie, Doctorant UP7

DAUTIN Nathalie, Doctorant UP7 : ndautin@pasteur.fr

HERVE Mireille, Chargé de Recherche 1 CNRS : mherve@pasteur.fr HUNKE Sabine, Post-doct. Allemande : shunke@pasteur.fr

PLANSON Anne-Gaëlle, Doctorant UP7 : planson@pasteur.fr

RENARD Martial, Doctorant UP6 : mrenard@pasteur.fr

ROSSY Emmanuel, Etudiant DEA UP11

ULLMANN Agnès, Professeur Honoraire IP, DREM CNRS : ullmann@pasteur.fr

BELKADI Laurent, Ingénieur d’Etudes CNRS : belkadi@pasteur.fr

NAGEOTTE Roland, Ingénieur Technologue P2 IP : nageotte@pasteur.fr

SASSOON-CLAVIER Nathalie, Technicien Supérieur de Labo. IP : nsassoon@pasteur.fr


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