Portail IP bandeau_genéral
  Arbofhem


  Responsable : DEUBEL Vincent (vdeubel@pasteur.fr)


  resume

 

L'unité des Arbovirus et virus des fièvres hémorragiques se consacre à l'étude de deux familles virales représentatives des virus transmissible à l'homme par des arthropodes, les Flaviviridae et les Bunyaviridae. Des recherches à caractère fondamental ont pour objet de comprendre les mécanismes de la réplication de ces virus à ARN et d'analyser les interactions fonctionnelles entre l'agent infectieux et leurs cellules hôtes. A l'interface de ces recherches, le Centre National de Référence développe des outils de diagnostic rapide pour la surveillance des maladies émergentes associées aux arbovirus et aux virus des fièvres hémorragiques.



  rapport

cale

Les arbovirus ont été initialement définis comme "maintenus dans la nature par un cycle de transmission biologique entre des hôtes vertébrés permissifs et des arthropodes hématophages". Certains d'entre eux ne correspondent pas à cette définition, mais ont été classés dans le catalogue des arbovirus pour leur apparenté écologique et non taxonomique. Plus de 100 virus pathogènes pour l'homme à des degrés divers sont universellement répertoriés. Ces virus entraînent des manifestations pathologiques qui sont à l'origine de symptomatologie inhérente liée à chaque virus (syndromes fébriles algiques, syndromes méningo-encéphalitiques, syndromes hémorragiques) pouvant conduire à la mort de l'hôte. Les virus des fièvres hémorragiques appartiennent aux familles des Bunyaviridae, des Flaviviridae, des Arenaviridae et des Filoviridae. La majorité de ces virus circule sous les tropiques, en raison de l'abondance des hôtes et des vecteurs: c'est notamment le cas des virus de la fièvre jaune, de la dengue, de l'encéphalite du Nil Occidental (West Nile) et de la fièvre de la vallée du Rift. Plusieurs d'entre ces virus sont cependant retrouvés dans les zones tempérées, en Europe centrale, de l'est et du sud. Au niveau national, trois virus majeurs sont sous haute surveillance : les flavivirus de l'encéphalite à tique d'Europe centrale et West-Nile, introduit épisodiquement par les oiseaux migrateurs, et un hantavirus dont le réservoir est un rongeur auprès duquel l'homme se contamine. Beaucoup d'inconnues demeurent aux niveaux moléculaire et épidémiologique sur les flavivirus, les bunyavirus et les filovirus. Notre Unité a développé en particulier des recherches pour six viroses importantes qui peuvent conduire à des encéphalites et des syndromes hémorragiques et qui posent de graves problèmes de Santé Publique dans plusieurs continents, et tout particulièrement dans les Départements et Territoires d'Outre-Mer ainsi que dans les pays où notre Institut est représenté: dengue, fièvre jaune, encéphalite de West Nile, fièvre de la vallée du Rift, fièvre hémorragique à virus Ebola, fièvre hémorragique avec syndrome rénal. Nos activités de recherche et de référence sur les arbovirus et les fièvres hémorragiques virales ont dépassé les frontières et sont menées en collaboration avec nos partenaires privilégiés du réseau international des Instituts Pasteur et Instituts associés. Ces collaborations sont d'une grande richesse et favorisent le développement de la recherche grâce à des transferts d'information, de matériel et de technologies.

Les virus de la dengue et de l'encéphalite de West Nile (V. Deubel)

La dengue est une maladie virale transmissible à l'homme par les moustiques du genre Aedes dans les régions tropicales et intertropicales qui ceinturent le globe. L'agent infectieux responsable de la maladie est un flavivirus (famille Flaviviridae) dont on distingue quatre sérotypes (dengue-1, -2, -3, et -4). L'infection par le virus dengue provoque généralement une fièvre non différenciée (fièvre dengue classique, DF, ou grippe des tropiques), ou est le plus souvent asymptomatique, mais elle peut entraîner des manifestations hémorragiques graves (fièvre hémorragique de la dengue, DHF), notifiées par une perméabilité vasculaire accrue et un dérèglement de l'hémostase. L'issue de la maladie peut être fatale en cas de choc hypovolémique (dengue avec syndrome de choc, DSS). Selon l'OMS, le nombre de cas annuels de dengue pourrait s'élever à 100 millions et le nombre de décès à 30.000. Les facteurs de l'hôte ou intrinsèques au virus responsables de la gravité de la maladie ne sont pas connus. Nos thématiques de recherche ont comme ligne directrice l'étude des marqueurs moléculaires de la diversité biologique du virus de la dengue qui déterminent de manière critique sa virulence et l'étude des mécanismes qui régissent les interactions du virus avec ses cellules hôtes.

Le virus West Nile se maintient dans la nature par transmission entre des moustiques du genre Culex et les oiseaux. L'Afrique constitue le foyer enzootique principal et le virus est introduit dans les zones tempérées par les oiseaux migrateurs. L'homme ou le cheval sont des hôtes sensibles au virus mais ne participent pas à l'amplification biologique du virus puisque la virémie est brève et faible. Le virus West Nile, considéré longtemps comme n'induisant le plus souvent que des infections bénignes avec de rares cas d'encéphalite, est la cause depuis six ans de fortes fièvres pouvant conduire à des encéphalites mortelles. Ces manifestations pathologiques ont été observées depuis 1996 chez l'homme, le cheval et les oiseaux au cours d'épidémies en Europe, en Afrique du Nord, au Moyen Orient, en Russie et aux Etats Unis. Une dégénération et une nécrose des neurones du système nerveux central ainsi qu'une inflammation diffuse sont les signes anatomopathologiques observés dans les encéphalites mortelles. Cependant, les marqueurs moléculaires de la virulence et de la sensibilité de l'hôte à l'infection demeurent inconnus. Nous avons initié depuis deux ans des recherches pour caractériser ces marqueurs.


Mécanismes de virulence du virus de la dengue (P. Desprès, M.P. Courageot, A. Catteau, M. Lucas, M.P. Frenkiel)

Le virus de la dengue induit la mort cellulaire par apoptose des neurones murins infectés. Nous avons étudié les facteurs viraux et cellulaires qui contribuent à la pathogénicité du virus de la dengue. L'étude comparative de variants viraux qui diffèrent par leur neurovirulence dans un modèle murin d'infection expérimentale a révélé que la protéine d'enveloppe E et l'hélicase virale NS3 portent des déterminants qui peuvent moduler la cinétique d'induction de la mort cellulaire apoptotique en réponse à l'infection par le virus de la dengue (Collaborations : C. Duarte Dos Santos, F. Rey)


Etude de la maturation de la particule virale (M.P. Courageot, P. Desprès, M.P. Frenkiel)

L'induction de l'apoptose dans les cellules infectées par le virus de la dengue est fonction de l'efficacité de la morphogenèse virale dans le réticulum endoplasmique (RE) et de la réplication virale. La maturation des glycoprotéines virales a été étudiée. Premièrement, l'étude de la morphogenèse du virus de la dengue a montré que l'hétérodimerisation des glycoprotéines prM (le précurseur intracellulaire de la protéine de membrane M) et E de l'enveloppe virale dans la lumière du RE est une étape préliminaire dans la formation de la particule virale. Le repliement correct des glycoprotéines prM et E dépendant de la maturation de leurs N-oligosaccharides est altéré par des inhibiteurs des a-glucosidases dans le RE. Nous avons démontré l'efficacité de ces inhibiteurs à bloquer la production de particules virales dans des cellules en culture infectées par le virus de la dengue. Deuxièmement, nous avons étudié les propriétés de la séquence à la jonction des protéines de capside C et prM qui est requise pour la translocation de la glycoprotéine prM dans la lumière du RE (collaboration: F. Pénin). Troisièmement, la contribution de prM et E dans l'activation du processus apoptotique a été testée dans une lignée cellulaire qui exprime les deux glycoprotéines virales sous la dépendance d'un promoteur exogène inductible. L'ectodomaine intraluminal de la protéine de structure M est une séquence virale candidate pour l'induction de l'apoptose.

Pathologie liée au virus West Nile (P. Desprès, A. Catteau, M. Lucas , M.T. Drouet, M.P. Frenkiel)

La pathogenèse de l'infection par des flavivirus dépend de plusieurs facteurs liés d'une part à la souche virale, à la dose infectante et à la voie d'inoculation et d'autre part à l'hôte, à son âge, à sa prédisposition génétique à l'infection et à son statut immunitaire. Une étude préliminaire a montré des différences importantes dans le pouvoir neuropathogène de différentes souches de virus West Nile ou d'une même souche mais inoculée par différentes voies. Un programme transversal de recherche sur le virus West Nile a été initié avec pour principal objectif l'identification des facteurs viraux et de l'hôte qui contribuent à la neuropathogénicité du virus West Nile dans le modèle murin d'infection expérimentale (Collaboration J.L. Guénet, P.E. Ceccaldi).


Propriétés biologiques de la glycoprotéine non structurale NS1 des flavivirus(S. Alcon, F. Coulibaly, M.-T. Drouet, F. Mégret et M. Flamand)

Conservée au sein du genre des flavivirus, la glycoprotéine non structurale NS1 est essentielle à la survie du virus. Il semble en effet qu'elle prenne part à la réplication virale, bien que son activité à proprement parler n'ait pas été identifiée. Nous avons choisi de nous intéresser aux formes extracellulaires de la protéine, observées lors d'infections flavivirales en cultures de cellules. Afin d'étudier les propriétés biologiques éventuelles de la forme sécrétée de NS1, nous avons dans un premier temps caractérisé son mode de maturation et de transport en cellules de rein de singe (lignée Vero) infectées par le virus de la dengue. Si la protéine NS1
réside en partie dans un compartiment précoce des voies de sécrétion, où sa présence pourrait être requise lors de la réplication virale, elle est alternativement sécrétée de manière hôte dépendante dans le milieu extracellulaire des cellules infectées sous la forme d'hexamères solubles et homogènes. Leur sécrétion est favorisée par la maturation complète de l'un des deux oligosaccharides, ce qui pourrait corroborer l'absence de sécrétion de la protéine dans des lignées de cellules d'insectes dont le système de biosynthèse des sucres génère des N-glycanes riches en mannoses.
La protéine NS1 a par ailleurs été mise en évidence dans le sérum de patients présentant les symptômes classiques d'une infection par le virus de la dengue. L'implication de la forme circulante de NS1 dans la pathophysiologie de l'infection flavivirale est en cours d'étude.
(Collaborateurs : M. Arborio, S. Dartevelle, A. Falconar, B. Goud, R. Hellio, J. Krinsje-Locker, J. Lepault, F. Nato, F. Rey, A. Talarmin)


Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (Michèle Bouloy)

Membre de la famille des Bunyaviridae (genre Phlebovirus), le virus de la fièvre de la vallée du Rift (FVR) est responsable de fièvres hémorragiques chez l'homme, et d'avortements et malformations du foetus chez les ruminants. Des épidémies ont eu lieu au Kenya, Somalie, Tanzanie et Mauritanie en 1997-99. En octobre 2000, le virus a franchi les frontières africaines et a provoqué une grave épidémie en Arabie Saoudite et au Yémen. Ce virus enveloppé possède un génome composé de trois segments d'ARN (L, M, S) de polarité négative dont un, le segment S, est ambisens et code pour deux protéines, la nucléoprotéine N et une protéine non structurale NSs dont la fonction n'est pas connue. L'étude de cette protéine a été au centre de nos préoccupations, avec comme ligne directrice l'analyse de ses propriétés biologiques et de la pathogénie associée au virus.


Transcription du virus de la fièvre de la vallée du Rift(Nicola Vahsen)

Le segment S exprime deux protéines selon une stratégie ambisens. Ces dernières sont traduites à partir deux ARNm de polarité opposée : l'ARNm codant pour N est de sens anti-génomique et l'ARNm codant pour NSs.est de sens génomique. A l'aide d'un mini-génome porteur du gène rapporteur CAT (Chloramphénicol Acetyle Transférase), nous avons montré que deux protéines, la nucléoprotéine N et la RNA polymérase RNA dépendante L, sont nécessaires pour la transcription. Dans ce système, les protéines virales ainsi que la protéine CAT sont synthétisés dans les cellules transfectées par les plasmides porteurs des séquences correspondantes sous la dépendance du promoteur T7. De ce fait, la synthèse requiert la présence de la T7 RNA polymérase qui est exprimée par le virus de la vaccine vTF7.3. Toutefois, ce virus provoque des effets cytopathogènes importants qui perturbent le métabolisme de la cellule infectée. Pour pallier ce problème, un autre système déjà utilisé pour la génétique inverse du virus de la grippe, est en cours de développement. Il utilise deux RNA polymérases cellulaires, la RNA polymérase I pour synthétiser les mini-génomes qui seront porteurs d'extrémités 5' triphosphate non coiffées (ou les segments génomiques) et la RNA polymérase II pour la synthèse des ARNm impliqués dans l'expression des protéines virales. Ainsi les deux types de plasmides sont en cours de construction: les plasmides génomiques S-CAT, possédant les séquences non codantes S et le gène CAT en orientation antisens sous la dépendance du promoteur polI murin et les plasmides pN et pL sous la dépendance du promoteur CMV. Ce système nous permettra d'étudier la réplication et rechercher un éventuel rôle de NSs ainsi que d'établir les bases d'un système de génétique inverse.


La protéine NSs (F. Yadani et A. Billecocq)

Dans les cellules infectées par la quasi totalité des souches, la protéine NSs se localise en majorité dans le noyau où elle forme des filaments. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation de filaments, la protéine a été exprimée à l'aide du vecteur Semliki. L'analyse de différents mutants ponctuels ou de délétion montre que le domaine formé par les dix acides aminés C-terminaux est responsable de la formation du filament mais pas de la localisation nucléaire. Dans la forme native de la protéine, ce domaine contient deux sérines qui sont phosphorylées et présentent une séquence consensus de reconnaissance par la caséine kinase II. Ces deux sites phosphorylés ne jouent pas de rôle important dans le processus de formation du filament car, la protéine où ces deux serines ont été mutées en alanine continue à former le filament nucléaire. Dans le cytoplasme, la protéine NSs se trouve associée à la beta-tubuline et co-localise avec les microtubules.(Collaboration : P. Denoulet, P. Roux et P. Gounon)


Un mutant naturel: le clone 13 Billecocq, P. Vialat)

Le clone 13 a été isolé d'une souche de virus provenant d'un cas humain en République Centrafricaine. Ce virus possède une délétion de 70% de la région codante pour la protéine NSs et il est avirulent pour les rongeurs qui représentent un excellent modèle animal. Dans les cellules infectées par le clone 13, la protéine NSs tronquée ne forme pas de filament et reste dans le cytoplasme où elle est dégradée. En outre, les cultures de cellules Vero infectées par Clone 13 peuvent être propagées pendant de nombreux passages et continuent à héberger le génome viral et à exprimer ses protéines. Des réassortants avec Clone 13 et une souche virulente ont permis de montrer que le segment S possède un déterminant important de l'atténuation. Ainsi le rôle majeur de la protéine NSs vient d'être mis en évidence : elle bloque la production d'interféron de type I. (collaboration : O. Haller)


Analyse phylogénétique (M. Bouloy, A.A. Sall)

La séquence codant pour la protéine NSs représente une cible de choix pour caractériser les souches entre elles. L'analyse phylogénétique d'une série de souches isolées de différentes régions d'Afrique au cours des 50 dernières années montre que les isolats se regroupent en trois classes géographiques: l'Afrique de l'Ouest, l'Afrique du Centre et de l'Est, l'Egypte. La séquence d'une souche isolée par R. Swanepoel (Joanesburg, Afrique du Sud) au cours de la dernière épidémie du Kenya de 1997-98 montre qu'elle appartient au groupe de l'Est et est génétiquement très proche d'une souche malgache isolée en 1991.


Centre national de référence et Centre collaborateur OMS des arbovirus et des fièvres hémorragiques virales Mises au point de techniques (A. Billecocq, D. Coudrier, M.T. Drouet, B. Murgue, S. Murri, H Zeller, M Bouloy)

Les protéines recombinantes NP et VP40 de la souche gabonaise de 1994 du virus Ebola ont été exprimées dans E. coli et purifiées. La GP de la même souche a été exprimée dans des cellules de mammifères à l'aide du réplicon dérivé du virus de la forêt de Semliki. Utilisées dans un test Elisa, elles permettent de révéler la présence d'anticorps chez les malades ou dans des échantillons prélevés pour des enquêtes visant à évaluer la circulation du virus.
Deux méthodes de diagnostic rapide (RT-PCR en temps réel) ont été mis au point pour le virus de la fièvre de la vallée du Rift et pour le virus Puumala. (Collaborations : A. Sall, D. Garin)


Détection et investigations d'épidémies(B. Murgue, S. Murri, D. Coudrier, I. Marendat, H. Zeller)

Le virus West Nile a été isolé par le CNR chez des chevaux le 6 Septembre 2000. Le CNR a ensuite initié une action coordonnée incluant plusieurs partenaires (Ministères de la Santé, de l'Agriculture, et de l'Environnement, et d'autres organismes) afin d'entreprendre une réponse à l'épidémie couvrant les différents aspects : vétérinaire, médical, entomologique, ornithologique, contrôle vectoriel.
En Octobre 2000, des fièvres hémorragiques étaient observées en Guinée équatoriale. Le CNR a été impliqué dans le diagnostic étiologique de la maladie et a confirmé que le virus de la fièvre jaune était l'agent responsable de l'épidémie. Le Centre a été impliqué dans le suivi de l'épidémie qui perdurait à la fin de l'année 2000. (Collaborations : S. Zientara, J Hars, JP Durand, L Koivogui, M. N'Faly, J ter Meulen, C. Lagneau.)


Diagnostic de la dengue et étude des cas d'importation(B. Murgue, S. Murri, I. Marendat, H. Zeller)

Des tests commerciaux pour le diagnostic sérologique de la dengue ont été comparés sur un même panel de sérums dans deux laboratoires différents, à Paris (CNR) et à Marseille (Institut de Médecine Tropical du Service de Santé des Armées). Les résultats sont en cours d'évaluation.
Une étude prospective de l'importance des cas de dengue d'importation a été réalisée en 2000 et les résultats sont en cours d'évaluation. (Collaborations: JP Durand, C Sadorge, L Pupin, X. Deparis)


Prédiction et prévention de la fièvre hémorragique avec syndrome rénal(H. Zeller, D. Coudrier, M. Bouloy, A. Billecocq, B. Murgue)

Des cas cliniques de fièvre hémorragique avec syndrome rénal (FHSR) dus à une infection par un Hantavirus, le virus Puumala (PUU), sont identifiés chaque année dans le nord-est de la France. Le réservoir du virus PUU en France est le rongeur Clethrionomys glareolus (campagnole roussâtre). Des épidémies de FHSR sont rapportées tous les trois ans, le dernier épisode ayant eu lieu en 1999 avec 115 cas. Une situation similaire est rapportée en Belgique, de l'autre côté de la frontière des Ardennes, département où la majorité des cas sont recensés. En 2000, 68 cas ont été diagnostiqués sérologiquement par le CNR (âge moyen 40 ans, sexe ratio M/F : 4/1). Une étude est en cours pour mieux comprendre l'épidémiologie de la FHSR et d'identifier les facteurs de risque. L'aspect vétérinaire comporte les études sur la dynamique des populations de rongeurs, sur leur distribution spatiale, sur les dynamiques de l'incidence de leur infection et sur des modèles épidémiologiques. Des captures-relâches de rongeurs réalisées dans des sites spécifiques servent aux mensurations et aux prises d'échantillon sanguin. Une très faible prévalence d'anticorps anti-PUU a été enregistrée cette année chez Clethrionomys glareolus capturés dans différents sites. Les sérologies de rongeurs pour le virus PUU sont à présent réalisées à Nancy, grâce à un transfert de technologie du CNR. L'utilisation d'antigènes recombinants préparés dans le système d'expression du virus Semliki forest pour la sérologie chez l'homme et les rongeurs est en cours d'évaluation.
Par ailleurs, une recherche d'hantavirus chez les rongeurs et chez l'homme fut conduite à Madagascar et au Cambodge en collaborations avec les Instituts Pasteur du réseau international. Une prévalence importante d'anticorps anti-hantavirus a été enregistrée chez les rongeurs dans les deux pays. Une étude phylogénique basée sur l ‘analyse comparative des séquences du segment S des virus a montré qu'il se rapprochaient du type asiatique (Seoul-like) et que leur évolution était liée à celle des rongeurs vecteurs. (Collaborations: C. Penalba, M. Artois, P. Vuillaume, D. Pontier, F. Sauvage, Boué, C. Janot, J.M. Reynes)



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BADELLA Jacqueline - Tél : (33) 01 40 61 35 15

MEIGNAN Marie-Laurence - Tél: (33) 01 40 61 35 15

MILLIOT Brigitte - Tél : (33) 01 40 61 31 45

BILLECOCQ Agnès, DSc

BOULOY Michèle, DSc

DESPRES Philippe, DU

DEUBEL Vincent, DSc

FLAMAND Marie, DU

MURGUE Bernadette, Médecin, DU

PREHAUD Christophe, DU

ZELLER Hervé, Pharmacien

CATTEAU Adeline, Thèse

COULIBALY Fasséli - Thèse

COURAGEOT Marie-Pierre - Thèse

LUCAS Marianne, Post-doctorant

YADANI Fatima - Stagiaire à temps partiel

LE MAY Nicolas, DEA

VAHSEN Nicola, Diploma thesis (Université de Heidelberg)

COUDRIER Daniel - Technicien

DROUET Marie-Thérèse - Technicien

FRENKIEL Marie-Pascale - Technicien

MEGRET Françoise - Ingénieur

MANDELAT Ingrid, Technicien

MURRI Séverine - Technicien

VIALAT Pierre - Technicien


filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr.