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  Responsable : COURVALIN Patrice (pcourval@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance aux aminosides chez les bacilles à Gram négatif ainsi que le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.



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Nouveau caractère de résistance aux glycopeptides chez les entérocoques.

La souche de E. faecalis BM4405, résistante à la vancomycine et sensible à la teicoplanine, synthétise des précurseurs du peptidoglycane terminés par D-alanine-D-sérine. L'opéron vanE, responsable de cette résistance, a été localisé sur le chromosome et a été caractérisé. Il comporte trois gènes nécessaires à la résistance vanE, vanXYE et vanTE, codant respectivement pour une ligase, une D,D-peptidase et une sérine racémase et deux gènes codant pour un système de régulation à deux composants, vanRE et vanSE. L'organisation de l'opéron vanE est donc similaire à celle de vanC, responsable de la résistance intrinsèque aux glycopeptides de E. gallinarum, E . casseliflavus-flavescens. Ceci pose l'intéressante question du mécanisme de transfert interspécifique d'un opéron entier " de ménage " entre entérocoques. Ceci sera d'abord étudié par détermination de la séquence de la région flanquant le groupe de gènes vanE.


Caractérisation du transposon Tn1549 conférant une résistance aux glycopeptides de type VanB chez les entérocoques.

Le transfert de la résistance aux glycopeptides de type VanB, résistance à la vancomycine mais pas à la teicoplanine, entre souches d'entérocoques est associé au transfert de larges éléments génétiques chromosomiques ou de plasmides. L'étude de l'environnement de l'opéron vanB chez des souches cliniques de Enterococcus a permis la caractérisation d'un transposon, Tn1549, de 34 kb localisé sur un plasmide apparenté au plasmide pAD1. Tn1549 comporte trente cadres ouverts de lecture et apparaît être organisé en trois régions fonctionnelles distinctes comme les transposons conjugatifs de type Tn916 auxquels il est apparenté: (i) La portion droite impliquée dans les processus d'excision et d'intégration; (ii) La portion centrale dans laquelle l'opéron vanB remplace le gène tet(M) conférant la résistance à la tétracycline; et (iii) L'extrémité gauche dans laquelle huit des dix huit cadres ouverts de lecture pourraient être impliqués dans le transfert conjugatif. Ce type d'élément pourrait rendre compte de la dissémination rapide de la résistance à la vancomycine chez les entérocoques.

Identification génotypique au niveau de l'espèce des entérocoques par détermination de la séquence des gènes codant pour les D-alanine:D-alanine ligases.

L'utilisation d'oligodésoxyribonucléotides dégénérés a permis l'amplification par PCR d'un fragment interne aux gènes ddl codant pour les D-alanine:D-alanine ligases de Enterococcus columbae, E. durans, E. malodoratus, E. mundtii, E. raffinosus, E. seriolicida, E. solitarius, et E. sulfureus. L'analyse phylogénétique de la séquence de ces produits d'amplification et de ceux déjà obtenus chez E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. dispar, E. faecalis, E. faecium, E. flavescens, E. gallinarum, E. hirae, E. pseudoavium, et E. saccharolyticus conduit à un arbre évolutif dont la topologie est similaire à celui obtenu par l'analyse de la séquence des ARN 16S. La détermination de la séquence partielle des gènes ddl peut être utilisée pour l'identification génotypique des espèces de Enterococcus.


Emergence de la résistance aux carbapénèmes chez Klebsiella pneumoniae.

La souche clinique de K. pneumoniae BM2974 isolée en Suède résiste à la plupart des antibiotiques y compris l'imipénème. La résistance résulte de l'association de deux mécanismes de résistance : production de la céphalosporinase CMY-4 médiée par un plasmide et la perte d'une protéine majeure de 40 kDa de la membrane externe.


Caractérisation moléculaire d'intégrons chez Acinetobacter baumannii.

Acinetobacter est un genre bactérien responsable d'infections opportunistes et multirésistant aux antibiotiques. L'analyse des intégrons présents dans des souches cliniques de A. baumannii a montré la prévalence élevée des intégrons de classe 1 alors qu'un intégron de classe 2 était retrouvé chez une seule souche. Les cassettes aac(3)-Ia, ant(2")-Ia, aac(6')-Ib et oxa20 ont été détectées ainsi que des structures composites contenant des séquences d'insertion. Enfin, un intégron hybride composé du gène de l'intégrase spécifique de la classe 2 et du segment 3' conservé des intégrons de classe 1 a été caractérisé. Ces résultats indiquent le rôle majeur des intégrons dans la résistance multiple de A. baumannii aux antibiotiques.


Transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères


Certaines espèces bactériennes ont la capacité de pénétrer les cellules de mammifères en induisant leur propre internalisation. Nous avons montré que des souches de Escherichia coli, rendues invasives et capables de lyser après leur entrée dans les cellules de mammifères par défaut de synthèse de la paroi bactérienne, sont capables de délivrer de l'ADN exogène plasmidique qui s'exprime dans ces cellules. Ce transfert direct de matériel génétique est efficace, à large spectre d'hôte et les vecteurs réplicatif ou intégratif ainsi délivrés sont hérités de façon stable et exprimés par la progénie des cellules qu'elles se divisent ou non. Le transfert s'observe également, bien qu'avec une efficacité moindre, des vecteurs bactériens aux épithélia différenciés digestifs ou pulmonaires. L'ADN délivré par l'invasion abortive de cellules eucaryotes par les bactéries présente un intérêt pour la stimulation de l'immunité mucosale et pour la thérapie génique humaine in vivo ou ex vivo.


Activité bactéricide de la gentamicine vis-à-vis de Enterococcus faecalis in vitro et in vivo.

L'activité de la gentamicine à diverses concentrations sur deux souches de E. faecalis a été étudiée in vitro et dans le modèle d'endocardite chez le lapin. In vitro, la gentamicine de 0,5 à 4 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI) ne réussissait pas à réduire le nombre de bactéries après 24 heures. Le sérum humain ou de lapin augmentait très significativement l'activité de la gentamicine dès que la concentration d'antibiotique dépassait la CMI. L'étude de la sensibilité en présence de sérum s'est avérée prédictive de l'activité in vivo ; cependant, la gentamicine sélectionnait des mutants résistants chez les lapins. L'activité intrinsèque de la gentamicine doit donc être prise en compte dans l'évaluation d'associations de gentamicine et d'antibiotiques actifs sur la paroi des entérocoques.


Activité in vitro de quinupristine/dalfopristine, contre des isolats cliniques de staphylocoques dans le monde

Nous avons évalué l'activité in vitro de l'association quinupristine/dalfopristine, une streptogramine, comparativement à celle de cinq antibiotiques, contre des isolats cliniques de staphylocoques. Une étude multicentrique in vitro a été effectuée sur des souches de staphylocoques non répétitives et d'importance clinique, isolées de patients hospitalisés dans 23 hôpitaux de 18 pays. La streptogramine a montré une excellente activité in vitro contre toutes les espèces de staphylocoques irrespectivement de leur profil de résistance aux autres classes d'antibiotiques, notamment la résistance à la méticilline. La synergie de l'association était conservée contre les souches résistantes aux macrolides.


Centre National de Référence des Antibiotiques

Les principales fonctions du Centre National de Référence des Antibiotiques sont l'étude de la prévalence de la résistance aux antibiotiques chez les genres bactériens pathogènes pour l'homme ; le maintien de collections de souches bactériennes de référence, de sondes nucléiques et de gènes de résistance ; l'évaluation de l'activité in vitro des antibiotiques nouveaux ; l'évaluation et l'amélioration de techniques ou d'appareils ou de détection de la résistance bactérienne aux antibiotiques ou de mécanismes de résistance ; et la mise au point de techniques de référence de détection de gènes de résistance.



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