Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Virologie et Immunologie cellulaire pour l'année 1999

CNRS URA 1930


Responsable : HOVANESSIAN Ara (arahovan@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Nous étudions les mécanismes impliqués dans la pathogénie du SIDA en relation avec l'infection par le virus d'immunodéficience humaine, VIH. Par ailleurs l'infection virale conduit à la production d'interféron, qui joue le rôle de première barrière contre l'extension de la virémie. Dans cette optique, les principales lignes de recherche sont les suivantes : 1) développement des inhibiteurs de l'infection par le VIH, 2) étude des composants à la surface cellulaire impliqués dans le processus d'accrochage du VIH, 3) clonage et caractérisation des 2'-5' oligoadenylate synthétase (2-5A synthétase), 4) caractérisation des différentes fonctions de la protéine kinase PKR.

Abstract

In order to clarify the mechanisms implicated in AIDS pathogenesis in relation to HIV infection, the members of this unit have concentrated their studies on the different steps in the HIV infectious cycle, and particularly on the viral entry process. As interferon protects cells against virus infections, studies are carried out in order to understand its mechanism of action. In this respect, the major lines of research are: 1) development of inhibitors of HIV infection, 2) characterization of cell-surface components implicated in the attachment of HIV particles to permissive cells, 3) cloning and characterization of 2'-5' oligoadenylate synthetases (2-5A synthetase), 4) characterization of the different functions of the protein kinase PKR.

Texte du rapport

La boucle V3 est nécessaire à la fixation des particules du VIH aux cellules cibles. (A. Hovanessian)
Précédemment, plusieurs équipes ont souligné le rôle critique du domaine V3 de la gp120 en relation avec les récepteurs des chimiokines. Nous avons démontré que le domaine V3 est également nécessaire à la fixation des particules virales aux cellules exprimant le récepteur CD4. Ainsi, des anticorps spécifiques pour V3, en se fixant sur les particules virales, empêchent leur accrochage aux cellules suggérant l'existence de récepteur(s) pour la boucle V3. Les chimiokines ou des inhibiteurs se fixant sur des récepteurs de chimiokines inhibent l'entrée du VIH sans affecter l'accrochage des particules virales, suggérant ainsi que les récepteurs de chimiokines bien qu'essentiels pour la fusion membranaire ne sont pas impliqués dans le processus de l'accrochage des particules virales aux cellules permissives.

5[K(psi)PR]-TASP est un inhibiteur spécifique de l'entrée du VIH. (B. Krust, S. Nisole, N. Seddiki, C. Callebaut, S. Loaec, M. Le Clech, A. Hovanessian) Cette construction a été définie après le motif dipeptidique RP conservé dans la boucle V3 des isolats des VIH. Nous avons démontré que ce pseudopeptide inhibe l’infection des cultures primaires des lymphocytes T et des macrophages par les divers isolats de VIH. Il est actif contre les VIH-1 et VIH-2, mais inactif dans le cas du SIV. De plus, ce pseudopeptide n'a pas d'effet sur les VIH-1 pseudotypés avec des glycoprotéines d'enveloppe du VSV ou MoMLV, démontrant ainsi qu'il est dirigé contre l'infection médiée par les glycoprotéines d'enveloppe du VIH. Cet inhibiteur spécifique pour le VIH étant extrêmement stable dans le plasma humain il représente un candidat de choix pour des essais thérapeutiques contre le VIH. (K=lysine, P=proline, R=arginine).

Étude de la cible de l'inhibiteur 5[K(psi)PR]-TASP. (S. Nisole, B. Krust, C. Callebaut, A. Hovanessian) Nous avons démontré que le pseudopeptide 5[K(psi)PR]-TASP (nommé HB-19) se fixe à la surface cellulaire de façon spécifique en formant un complexe avec une protéine de 95 kDa identifiée comme étant la nucléoline. Les particules virales du VIH bloquent la fixation de HB-19 aux cellules et inhibent la formation du complexe avec la nucléoline. Une telle compétition entre les particules virales et HB-19 tendent à démontrer l'implication de la nucléoline dans le mécanisme d'accrochage du VIH à ses cellules cibles. En revanche, nous n'avons pas observé de compétition entre HB-19 et le facteur de croissance FGF-2, dont les sulfates d'héparane constituent les récepteurs de faible affinité. Ce fait exclut la possibilité que les sulfates d'héparane puissent être l'une des cibles de HB-19. En revanche, en accord avec le fait que les sulfates d'héparane jouent un rôle dans la fixation du VIH, nous avons montré que la fixation du facteur FGF-2 aux cellules conduit à une inhibition de la fixation du VIH et par voie de conséquence de l'infection. Nos résultats tendent donc à prouver que la nucléoline constitue un récepteur spécifique impliqué dans l'étape initiale d'attachement des particules de VIH à ses cellules-cibles. L'attachement du virus avec la surface cellulaire ferait donc intervenir deux types d'interaction, l'une aspécifique et de faible affinité avec les sulfates d'héparane et l'autre spécifique, de plus forte affinité, avec la nucléoline.

Le rôle potentiel de la nucléoline de surface dans l'infection par le VIH. (S. Nisole, B. Krust, M. Le Clech, J. Svab, N. Robert, A. Hovanessian). La nucléoline est une protéine ubiquitaire, extrêmement conservée chez différentes espèces animales. Nous avons tout d'abord entrepris une étude de biologie cellulaire, visant à mieux comprendre l'expression de surface de la nucléoline, expression déjà décrite mais jamais étudiée. Par microscopie confocale et électronique, nous avons montré que la nucléoline est présente dans le cytoplasme, au sein de structures vésiculaire, qui pourraient être impliquées dans la translocation de la nucléoline à la surface cellulaire. La translocation de la nucléoline est réduite à basse température ou en absence de sérum, alors que les inhibiteurs conventionnels du transport intracellulaire des glycoprotéines sont sans effet. La translocation de la nucléoline paraît donc une conséquence d'un transport actif, indépendant du complexe reticulum-Golgi. A la surface cellulaire, les anticorps monoclonaux dirigés contre la nucléoline provoquent une agrégation de la nucléoline au niveau de la phase extracellulaire de la membrane plasmique. Cette agrégation de la nucléoline de surface est dépendante de son association avec le cytosquelette de l'actine intracellulaire. Par conséquent la destruction du réseau d'actine par la cytochalasine D entraîne une désorganisation de la nucléoline de surface mais toujours associée avec l'actine agrégée . Ces observations suggèrent fortement que la nucléoline est un composant de la matrice extracellulaire, en étroite association avec l'actine, association probablement due à une tierce protéine transmembranaire, vraisemblablement un protéoglycane. Dans ces conditions, la nucléoline pourrait constituer le récepteur de surface des différents ligands.

L'entrée du VIH dans les cellules CD4+ entraîne la translocation de la nucléoline de surface vers le cytoplasme. (S. Nisole, B. Krust, M. Le Clech, J. Svab, N. Robert, A. Hovanessian). La translocation cytoplasmique et/ou nucléaire de ligands de la nucléoline de surface a été décrite à plusieurs reprises dans la littérature. Nous avons donc entrepris d'étudier le devenir de la nucléoline de surface au cous de l'infection virale. Nous avons démontré que l'expression de la nucléoline présente au niveau de la surface cellulaire est réduite de façon drastique suite à l'entrée des particules de VIH. Cette réduction est systématiquement observée dans différents types cellulaires 5 heures après infection et est strictement corrélée à la capacité d'un isolat donné à infecter sa cellule-cible. L'entrée du VIH dans les cellules est responsable de cette diminution puisque celle-ci n'intervient pas suite à l'inhibition de l'entrée virale par des agents qui empêchent la fusion membranaire sans affecter la fixation des particules du VIH. De plus, l'inhibition de la rétrotranscription par l'AZT n'a aucun effet sur la réduction de la nucléoline de surface du fait que l'AZT n'intervient pas sur l'entrée du VIH. Des expériences détaillées sur des cellules HeLa et sur des macrophages primaires ont démontré que la réduction du taux d'expression de la nucléoline à la surface cellulaire est une conséquence d'une translocation de la nucléoline de surface vers le cytoplasme au cours de l'entrée virale. De plus, cette translocation semble être corrélée à une augmentation de l'association de la nucléoline avec le cytosquelette. Etant donné que la nucléoline a été décrite comme une protéine navette, elle pourrait constituer une protéine "chaperon" pour le VIH lors de l'infection.

Le facteur de croissance Midkine est une cytoline qui inhibe l'infection par le VIH. (B. Krust, S. Nisole, C. Callebaut, A. Hovanessian). Partant de l'observation trouvée dans la littérature, selon laquelle le facteur de croissance Midkine (MK) pourrait interagir avec la nucléoline, nous avons étudié l'activité anti-VIH potentielle de ce facteur physiologique. Dans un premier temps, nous avons démontré que la MK se fixe spécifiquement à la surface cellulaire et que cette fixation est inhibée par HB-19. Par conséquent, différentes préparations de la MK se sont avérées capables d'inhiber l'infection par le VIH en bloquant l'accrochage des particules virales aux cellules pré-traitées. L’ARN messager de MK est détectable dans les cellules mononucléées du sang périphérique de donneurs sains, et son expression est fortement augmentée après activation des lymphocytes T. Le mode d’action anti-VIH de MK et l’induction transitoire de son expression dans les lymphocytes en réponse à divers stimuli, tendent à démontrer que MK est une cytokine impliquée dans la pathogénèse associée à l’infection par le VIH. En accord avec ceci, des clones de cellules CEM qui expriment de façon constitutive MK présentent une résistance à l’infection par le VIH, résistance liée à un blocage de la fixation des particules virales. Par ailleurs la coculture de cellules HeLa qui expriment MK avec des cellules HeLa CD4+ confère à ces dernières une résistance au VIH.

Étude du mode d'action de deux enzymes induites par l'Interféron et dépendantes d'ARN bicaténaire. (A. Hovanessian, I. Marié, E. Meurs)
Les interférons (IFN) sont induits dans différents types cellulaires en réponse à une infection virale par les voies de signalisation NF-kB, IRF et JNK. A leur tour, ils induisent la synthèse de nombreux gènes (plus de 250) par la voie de signalisation JAK/STATs. L’action combinée de différents gènes induits par IFN donne à la cellule la possibilité de « choisir » la réponse antivirale la plus appropriée, en fonction de la localisation cellulaire et du mode de réplication du virus infectant. Les voies antivirales les mieux caractérisées à ce jour sont les voies Mx, 2-5A synthetase/RNAse L et PKR. Parmi les gènes induits par l'interféron, nous étudions la fonction de la 2-5A synthétase et la PKR (Protéine Kinase Régulée par l’ARN bicaténaire), deux enzymes activées par l'ARN bicaténaire et/ou par un ARN monocaténaire de structure secondaire en épingle à cheveux. Ces enzymes régulent le métabolisme cellulaire et jouent un rôle important dans l’action antivirale de l’interféron. Les travaux se poursuivent pour préciser leurs fonctions.

Clonage des 2-5A synthétases de 69 et 100 kDa. (I. Marié, D. Rebouillat, A. Hovanessian) Les 2-5A synthétases appartiennent à une famille multigénique de protéines de 40-46, 69 et 100 kDa. Le gène codant pour les protéines p40-46 a été cloné par différents groupes. Nous avons réalisé le clonage et la caractérisation de plusieurs ADNc apparentés à la 2-5A synthétase p69 et le clonage de la p100 vient d'être réalisé. L'ADNc complet codant pour p100 code pour une phase ouverte de lecture constituée de 1083 acides aminés générant une protéine de poids moléculaire théorique: 120 kDa, en accord avec le poids moléculaire apparent de 100 kDa observée pour p100. L'analyse de la séquence de cette phase ouverte de lecture démontre que p100 est structurée en trois domaines homologues les uns aux autres et homologues au domaine synthétase "classique" correspondant à la 2-5A synthétase humaine de 40 kDa. Chacun des domaines contient également les signatures peptidiques spécifiques de la famille des 2-5A synthétases, constitués de motifs peptidiques ultraconservés et correspondant aux motifs catalytiques et à des motifs de fixation de cofacteurs comme l'ARN bicatenaire.

Caractérisation de la synthétase de 69 kDa. (I. Marié, D. Rebouillat, A. Hovanessian) La 2-5A synthétase de 69 kDa est composée de deux isoformes de 687 et 727 acides aminés nommés respectivement p69 et p71. Les premiers 683 acides aminés de ces deux isoformes qui sont identiques peuvent être divisés en deux domaines adjacents homologues présentant chacun une forte homologie avec la synthétase de 40 kDa. Ces résultats suggèrent que p69/p71 possèdent deux domaines catalytiques fonctionnels requis pour l'activité 2-5A synthétase. Nous avons démontré que chaque domaine, N- et C-terminal, ne possède pas une activité catalytique. Par ailleurs, le domaine C-terminal a démontré une affinité dix fois plus élevée pour l'ARN bicaténaire par rapport au domaine N-terminal. Afin d'aborder une étude comparative des propriétés de p69 et p71, nous avons établi des clones de cellules murines exprimant chaque isoforme. p69 et p71 présentent la même localisation cytoplasmique ponctuée (probablement en association avec le réticulum endoplasmique et la paroi externe de la membrane nucléaire). La présence d'une "queue" hydrophile dans la protéine p71 ne semble pas modifier son adressage cellulaire par rapport à la protéine p69. Enfin l'expression stable de la p69 ou p71 dans des cellules murines requiert une résistance à une infection virale.

Localisation de la protéine induite par l'interféron de 56 kDa homologue à la 2-5A synthétase. (D. Rebouillat, A. Hovanessian) Nous avons isolé un ADNc codant pour une protéine de 56 kDa induite par l'interféron. La séquence en acides aminés de cette protéine est fortement homologue à celle des 2-5A synthétases 40-46, 69 et 100 kDa. En revanche, cette protéine ne semble pas posséder la capacité de synthétiser du 2-5A. La protéine 56 kDa a une localisation cytoplasmique et nucléolaire. Le gène codant la protéine 56 kDa est localisé sur le chromosome 12q24.2 en dehors du cluster de gènes regroupant les trois formes de la 2-5A synthétases humaines de 40 /46, 69/71, et 100 kDa, localisé aussi sur le chromosome 12q24.2. Le gène de la protéine de 56 kDa se trouve à une distance d'au moins 1 Mb telomerique de ce cluster. (En collaboration avec Marie-Geneviève Mattéi à la Faculté de Médecine de la Timone à Marseille et Alain Hovnanian à l'Université d'Oxford).

La PKR interagit avec la sous-unité IKKb du complexe IKK et active la voie de signalisation NF-kB (E.Meurs, M. Bonnet) Nous étudions le mécanisme d’action de la PKR, une protéine kinase qui s’active par autophosphorylation après liaison sur des ARNs bicaténaires. Une fois activée, la PKR phosphoryle la sous-unité a du facteur d’initiation de la synthèse protéique eIF2, ce qui entraîne l’inhibitionde la synthèse protéique. La PKR est également impliquée dans la stimulation d’expression de gènes par activation de la voie de signalisation NF-kB ainsi que dans des mécanismes d’apoptose, en particulier en réponse à une infection virale ou au traitement à l’ARN bicaténaire. Nous étudions par quel(s) mécanisme(s) la PKR active NF-kB. Par transfection transitoire, nous avons montré que la PKR, sous forme catalytiquement inactive, stimule l’expression d’un gène rapporteur sous contrôle de promoteurs contenant des éléments de réponse à NF-kB. La transfection de différentes constructions la PKR, sauvage ou inactive, dans des fibroblastes embryonnaires de souris invalidées pour la PKR, ainsi que des analyses de retard sur gel et des expériences directes d’interaction protéine/protéine, nous a permis de démontrer ensuite que la stimulation de NF-kB par la PKR n’utilise pas sa fonction kinase conduisant à l’inhibition de la synthèse protéique. L’activation de NF-kB par la PKR se produirait par interaction de la PKR avec la sous-unité IKKb du complexe de kinases responsables de la phosphorylation de IkBa, l’inhibiteur cellulaire de NF-kB.

Le contrôle de la traduction par la PKR et la RNAse L active la voie de signalisation JNK (E Meurs, Bruce Magun). Nous explorons le rôle de la PKR dans différentes voies de signalisation autres que NF-kB, en particulier les voies JNK et p38MAPkinase. Dans un travail initié au cours d’un stage sabbatique de Bruce Magun dans le laboratoire, nous avons montré que le traitement des cellules par un ARN bicaténaire ou l’infection de cellules par le virus EMCV, entraine l’activation de JNK et de p38MAPKinase. L’activation de JNK a lieu, via le contrôle négatif sur la traduction exercé par la PKR et la RNAse L, probablement par l’arrêt de synthèse d’un inhibiteur de JNK. En revanche, l’activation de p38MAPkinase est indépendante des voies PKR et RNAse L.

Mécanismes d’action de la PKR et de l’interféron dans un modèle de pathogenèse virale: infection par virus de l’Hépatite C (E.Meurs en collaboration avec G.Duverlie -CHU Amiens) L’IFN, en combinaison avec la ribavirine, est le seul traitement efficace contre VHC, qui infecte pllus de 170 millions de personnes dans le monde. Son efficacité est cependant limitée. Le développement de stratégies vaccinales et de nouvelles drogues antivirales nécessite de comprendre les mécanismes de résistance du VHC à l’IFN. Deux protéines du VHC (NS5A et E2) ont été rapportées par différents groupes comme inhibiteurs de la PKR, à partir de clones stables ou inductibles exprimant NS5A ou E2 individuellement. Dans une étude récente, nous avons utilisé une lignée cellulaire inductible pour toutes les protéines du VHC. Dans ce contexte, nous montrons que la résistance à l’action de l’interféron ne peut être attribuée à une inhibition de la PKR. Notre étude souligne donc l’importance d’étudier l’action du VHC sur la cellule dans le contexte le plus proche d’une infection naturelle, afin d’éviter des interactions artificielles entre des protéines du VHC exprimées individuellement et des voies d’expression cellulaires. Nous entreprenons maintenant la détermination des gènes cellulaires induits par l’IFN et des voies de signalisation qui sont modifiés au cours de l’infection par le VHC.

Phosphoprotéines nucléaires induites par l'interféron. (E. Meurs, G. Welsh) Deux phosphoprotéines nucléaires induites par l'interféron ont été clonées au laboratoire. Ces protéines ont des signatures communes avec d'autres protéines nucléaires (SP100 et suppressine). Elles sont très homologues, divergent à leurs extrémités et n'interagissent pas directement entre elles. Elles sont localisées respectivement dans le nucléole et le nucléoplasme et colocalisent à l'anneau externe du nucléole, lieu de synthèse des rARNs.

Mots clés : HIV, interféron, nucléoline, pseudopeptide, 2-5A synthétase, protéine kinase PKR, NF-kB.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

JEWIARZ Danielle, IP djewiarz@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

HOVANESSIAN Ara, CNRS arahovan@pasteur.fr KRUST Bernard, INSERM bkrust@pasteur.fr MARIE Isabelle, IP (post-doc USA)
MEURS Éliane, IP emeurs@pasteur.fr
REY-CUILLE Marie-Anne, CNRS (post-doc USA)

Stagiaires de l'unité

BONNET Marion, Thésard
CALLEBAUT Christian, Post-Doc
HERRANT Magalie, Stagiaire
LE CLECH Mikael, D.E.A.
NISOLE Sébastien, Thésard
SEDDIKI Nabila, Post-Doc

Autre personnel de l'unité

LOAEC Solen, IP
ROBERT Nadine, IP
SVAB Josette, CNRS

Publications de l'unité

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