Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Recombinaison et Expression génétique pour l'année 1999

INSERM U.163


Responsable : TIOLLAIS Pierre (tiollais@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité de Recombinaison et Expression Génétique effectue des recherches sur l'oncogénèse, la virologie moléculaire et le vaccin recombinant contre l'hépatite B. Le virus de l'hépatite B (HBV) peut engendrer un cancer du foie et il est par conséquent très important d'élucider les mécanismes par lesquels ce virus provoque ce cancer. Nous cherchons à identifier des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans ce type de cancer. Notre laboratoire étudie également le rôle des protéines PML, RAR-alpha et PML-RAR-alpha dans la leucémie aiguë à promyélocytes. Nous avons également initié des travaux sur le virus de l'hépatite C dont on connaît mal le mécanisme de réplication, en vue de préciser les partenaires viraux et cellulaires de la polymérase virale. Nous participons à un protocole de vaccinothérapie des porteurs chroniques du virus de l’hépatite B basé sur l’utilisation du vaccin recombinant actuel. Nous avons mis au point un vaccin génétique anti-hépatite B basé sur l’utilisation de vecteurs ADN codant pour les protéines d’enveloppe du virus.

Abstract

The "Unité de Recombinaison et Expression Génétique" conducts research on oncogenesis, molecular virology and hepatitis B recombinant vaccine. The hepatitis B virus (HBV) can induce liver cancer and it is therefore very important to understand the mechanisms underlying this viral oncogenesis. We are trying to identify tumor suppressor genes involved in this cancer. Our laboratory is also studying the role of the PML, RAR-alpha and PML-RAR-alpha oncogenic proteins in promyelocytic acute leukemia. We have also initiated research on hepatitis C virus. The replication mechanism of this virus is poorly understood and we are therefore attempting to elucidate the viral and cellular partners of the viral polymerase. We participate in a vaccinotherapy trial of HBV chronic carriers using the recombinant vaccine. We have developed a genetic vaccine against hepatitis B. The DNA vectors used code for the envelope proteins of the virus.

Texte du rapport

Virus de l'hépatite B et hépatocarcinome (Marie Annick BUENDIA)
L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV) est un facteur de risque majeur pour le développement du cancer du foie, mais le rôle du virus dans le processus tumoral reste mal défini. Chez la marmotte infectée par un hépadnavirus (WHV) étroitement apparenté à l'HBV, l'intégration virale près des gènes c-myc et N-myc est un événement déterminant de l'hépatocarcinogénèse viro-induite. Nous avons établi plusieurs lignées de souris transgéniques qui récapitulent les étapes du processus tumoral, notamment une lignée exprimant le gène de marmotte N-myc2. Par ailleurs, nous avons mis en évidence un rôle de promoteur de tumeur pour le gène régulateur X de l'HBV dans un modèle transgénique, et nos études récentes ont montré que la protéine transactivatrice HBX exerce une fonction pro-apoptotique dans les cellules hépatiques in vivo et in vitro, indépendamment de la présence d'un gène p53 fonctionnel. HBX est capable de bloquer l'effet anti-apoptotique de Bcl-2 dans le foie et d'activer l'expression du ligand de Fas. Le rôle cette protéine virale dans l'hépatocarcinogénèse est aussi abordé par l'étude de sa capacité à déréguler le cycle cellulaire dans des cellules normales humaines et murines en culture primaire, et par la recherche des gènes cellulaires cibles de la transactivation par le gène X.

Mécanismes moléculaires de l'oncogénèse hépatique (Marie Annick BUENDIA)
Nous étudions les étapes moléculaires de la carcinogenèse hépatique chez l'homme et dans des modèles transgéniques murins. Des mutations fréquentes de la beta-catenine induisant la stabilisation et l'accumulation nucléaire de la protéine ont été récemment mises en évidence dans l'hépatocarcinome humain et murin. Nous avons montré que l'activation oncogénique de la beta-caténine dans 30% des hépatocarcinomes humains est associée à une prolifération accrue des cellules tumorales. Nous cherchons à caractériser l'impact de cet oncogène sur le pouvoir invasif de la tumeur et la survie des patients atteints de cancer du foie. Nous avons récemment montré que l'activation de la voie Wnt/beta-caténine joue un rôle prépondérant dans le développement de l'hépatoblastome, une tumeur hépatique embryonnaire. Par ailleurs, nous recherchons les partenaires cellulaires de la beta-caténine dans le foie ainsi que les gènes cibles activés par le complexe beta-caténine/Tcf dans le contexte hépatique. Afin d'identifier certains gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans l'hépatocarcinogénèse, nous avons cartographié les pertes d'allèle les plus fréquentes sur l'ensemble des chromosomes humains dans une série d'hépatocarcinomes. Une étude fine des chromosomes 1 et 16 avec une haute densité de marqueurs microsatellites a montré de fréquentes pertes alléliques dans plusieurs régions chromosomiques pour lesquelles aucun gène suppresseur de tumeur n'a encore été identifié. En parallèle, nous avons réalisé un allélotypage complet de l'hépatocarcinome induit par c-myc chez la souris. La comparaison des anomalies génétiques dans ce système avec les résultats obtenus chez l'homme pourrait permettre de mettre en évidence des mécanismes communs de transformation hépatocellulaire.

Recherche de gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans le développement du cancer du foie (Anne DEJEAN)
L’inactivation somatique de gènes suppresseurs de tumeur (GST) est d’importance majeure dans le développement des cancers humains. Dans le but d’identifier des GST potentiellement inactivés au cours du développement du cancer du foie, une cartographie des pertes d’allèles les plus fréquentes a été réalisée sur l’ensemble des chromosomes humains dans plus de 120 hépatocarcinomes (HCC). Cet allélotypage nous a permis de mettre en évidence des pertes de matériel génétique fréquentes en 1p, 4q, 6q, 8p, 13q et 16p. Une région de 2cM en 8p23 fait déjà l’objet d’une étude approfondie. Un deuxième allélotypage restreint à l’analyse du chromosome 8 et réalisé sur 110 nouveaux cas d’HCCs a révélé l’existence de deux autres régions fréquemment délétées en 8p21/22 suggérant la présence de deux nouveaux GST dans ces régions. Afin d’identifier ces gènes nous avons étendu notre allélotypage secondaire à 200 nouveaux cas d’HCCs. Parallèlement, nous recherchons des délétions doubles et/ou hétérozygotes dans une centaine de lignées cellulaires tumorales (dont 60 d’origine hépato-biliaire). Des gènes candidats seront potentiellement identifiés dans les régions minimales de perte et des mutations ponctuelles somatiques seront recherchées dans ces gènes. Ces recherches, focalisées dans un premier temps sur le chromosome 8, seront par la suite étendues à d’autres régions chromosomiques, notamment la région 4q.

Bases moléculaires de la leucémie aiguë promyélocytaire (Anne DEJEAN)
Notre équipe étudie depuis plusieurs années le rôle des récepteurs aux rétinoïdes dans l'oncogénèse chez l'homme. Nous avons pu montrer que la translocation t(15,17) associée aux leucémies aiguës promyélocytaires (LAP) génère une protéine hybride entre la protéine PML et le récepteur alpha de l'acide rétinoïque (PML-RAR-alpha). La protéine PML est localisée au niveau de structures subnucléaires appelées corps nucléaires qui sont désorganisés de manière réversible par l'acide rétinoïque (AR) dans les cellules LAP. Cette observation, qui permet d'impliquer une structure nucléaire dans une pathologie humaine, corrèle de façon frappante avec l'effet thérapeutique de l'AR dans ce type d'hémopathie. Nous avons montré récemment que les protéines PML et SP100, les deux protéines des corps nucléaires connues à ce jour, sont modifiées de façon covalente par une petite protéine de 15 kd, SUMO-1. Cette modification, contrairement à l’ubiquitination, n’est pas associée à une dégradation protéique mais semble être responsable de l’adressage des protéines PML et SP100 vers les corps nucléaires. Nos travaux viseront d'une part à tenter d'élucider la fonction des structures nucléaires PML et notamment le rôle de cette nouvelle voie de modification post-traductionnelle SUMO-1 et d'autre part à clarifier le mécanisme d'action de l'hybride PML-RAR-alpha dans la genèse des LAP.

Antigène HBs et vaccination
(Marie-Louise MICHEL)
La vaccination génétique, alternative à la vaccination classique, consiste à induire une réponse immunitaire à une protéine, exprimée in vivo directement à partir d'un ADN plasmidique nu. Nous avons développé un modèle de vaccin génétique anti-hépatite B, basé sur l'utilisation de vecteurs plasmidiques codant pour les trois protéines d'enveloppe du virus. Ce nouveau mode d’immunisation a été validé chez le primate en vue d’un éventuel passage à l’homme. Nous avons pu montrer que des Macaques Rhésus immunisés avec ces vecteurs développent une réponse anticorps anti-HBs à un niveau compatible avec une protection chez l’homme ainsi qu’une fréquence élevée de cellules T cytotoxiques spécifiques du virus HBV. De nouveaux vecteurs mettant en jeux des promoteurs spécifiques du tissu musculaire ont été construits et ont été étudiés chez la souris. Bien que l’expression de l’antigène par ces vecteurs soit restreinte aux cellules musculaires, on peut mettre en évidence chez les animaux immunisés des réponses humorales et cytotoxiques comparables à celles obtenues avec des vecteurs ubiquitaires (collaboration avec D. Paulin, I.P.). En parallèle, en utilisant comme modèle des porteurs chroniques de l’HBV, des souris transgéniques pour l'AgHBs, nous avons montré que la vaccination génétique permet de lever la tolérance à l'AgHBs, d’induire sa clairance sérique et de contrôler dans le foie des souris l'expression des gènes viraux. L’analyse de la réponse immunitaire induite chez ces souris après vaccination génétique, a mis en évidence le rôle des cellules T CD4+ et CD8+ dans le contrôle in vivo de l’expression des gènes viraux au niveau du foie. Cette régulation s’effectue en l’absence de toute attaque lytique du foie et met en jeu des cytokines de type Th1 sécrétées par les cellules T activées. La vaccination génétique pourrait ainsi être une approche efficace pour le traitement des porteurs chroniques du virus HBV. Nous participons à un essai multicentrique randomisé de vaccination thérapeutique des porteurs chroniques du virus HBV, conduit par le Pr. C. Bréchot (Faculté de Médecine Necker), utilisant du vaccin recombinant classique. Nous avons pu mettre en évidence chez certains patients vaccinés des réponses humorales et cellulaires (de type T auxiliaire Th1) induites par la vaccination et spécifiques des régions preS2 et S de l’enveloppe virale. Ces réponses sont détectées chez des patients pour lesquels on observe également une forte diminution ou une élimination de l’ADN viral circulant. L'AgHBs étant un immunogène particulièrement efficace, nous l'avons également utilisé comme système de présentation d'épitopes B et T hétérologues (HIV, epitopes tumoraux). En collaboration avec Y. Rivière (I.P.), nous avons utilisé des vecteurs ADN codant pour des antigènes hybrides HIV-1/HBs pour induire chez des macaques Rhésus une immunité humorale et cellulaire (cytotoxique) spécifique des virus HBV et HIV. L’injection de vecteurs codant pour un polyépitope mélanome fusionné à l’antigène HBs à induit chez des souris transgéniques HLA-A2 des réponses cytotoxiques restreintes par cette molécule et spécifiques de plusieurs épitopes du mélanome suggérant que cette approche pourrait être utilisée chez l’homme.

Relation entre les virus d’hépatites B (HBV) et C (HCV) et leur cellule hôte (Catherine TRANSY)
Les virus d’hépatite B et C sont tous deux la source de problèmes de santé publique majeurs, d’autant plus préoccupants que les traitements anti-viraux actuellement disponibles montrent une efficacité limitée. Dans ce contexte, nos études visent à caractériser les interactions moléculaires mises en jeu par HBV et HCV, au cours de leur cycle viral, dans le but de définir de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou d'améliorer l'efficacité des médicaments utilisés . La protéine régulatrice X du virus HBV est indispensable à l'établissement de l'infection bien que son rôle précis n'ait pas été identifié. Nous avons montré que l’interaction entre X et la protéine cellulaire UVDDB est déterminante, non seulement pour les activités de la protéine virale mesurables in vitro (propriétés transactivatrice et proapoptotique), mais aussi pour l’établissement d’une infection virale productive. Nous avons par ailleurs isolé et caractérisé un mutant X cis-inactif, mais trans-dominant négatif vis à vis de la protéine sauvage, de par son aptitude à entrer efficacement en compétition avec cette dernière pour la liaison à UVDDB. Cette observation nous oriente vers la mise au point de cribles permettant d’isoler des molécules anti-virales, sur la base de leur aptitude à inhiber l’interaction X-UVDDB ou l’activité proapoptotique de la protéine virale. En raison de l'absence de système cellulaire permettant de propager le virus HCV, on connaît mal la nature et la fonction des interactions entre les protéines virales matures, qui dérivent de la protéolyse d'un précurseur unique. En utilisant une approche globale fondée sur l’expression de domaines aléatoires de la polyprotéine virale, nous avons pu révéler des interactions virus-virus impliquant notamment les protéases virales (collaboration avec le laboratoire LMA de l’Institut Pasteur). A partir des domaines minimaux mis en jeu dans ces interactions, nous avons dérivé des mutants de gain d’affinité susceptibles d’inhiber les interactions natives. L’effet inhibiteur potentiel de ces molécules pourra être évalué grâce aux différentes méthodes de dosage des activités protéasiques virales que nous avons mis au point.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DA Louise-Marie, IP

Chercheurs de l'unité

BUENDIA Marie-Annick, CNRS, mbuendia@pasteur.fr DEJEAN Anne, INSERM, adejean@pasteur.fr NEUVEUT Christine, INSERM, cneuveut@pasteur.fr TRANSY Catherine, INSERM, ctransy@pasteur.fr WEI Yu, IP, ywei@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

KIRSH Olivier, Thèse
LEHEMBRE François, Thèse
LEVY Laurence, Thèse
LOIRAT Delphine, Thèse
MARSAC Delphine, Thèse
MÜLLER Stefan, Post-doc
PINEAU Pascal, Post-doc
SEELER Jacob, Post-doc
WU Yuanfei, Thèse

Autre personnel de l'unité

BERGAMETTI Françoise, P7
MALANCHERE Evelyne, IP
MARCHIO Agnès, IP
MICHEL Marie-Louise, INSERM
PRIGENT Sylvie, INSERM
RENARD Claire-Angélique, IP

Publications de l'unité

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