Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Toxines et Pathogénie bactérienne pour l'année 1999

CNRS URA 1858


Responsable : MOCK Michèle (mmock@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La thématique porte sur l'étude des mécanismes de virulence d'une bactérie toxinogène à multiplication extracellulaire : Bacillus anthracis. Cette bactérie, pathogène pour l'homme et l'animal, est l'agent de la maladie du charbon. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de toxines et la formation d'une capsule. Les spores de B. anthracis ont la capacité de germer dans les macrophages. La structure et le mode d'action cellulaire des toxines et leur rôle dans la pathogenèse sont étudiés. D'autre part, la surface de la bactérie, couche S et capsule, et son rôle dans l'interaction de ce pathogène avec l'hôte sont analysés. Enfin, B. anthracis peut être utilisé pour la production de protéines étrangères et comme vecteur vaccinal pour la présentation d'antigènes hétérologues in vivo. B. anthracis appartient au groupe Bacillus cereus et est en fait génétiquement la même espèce que B. cereus et B. thuringiensis.

Mots-clés: Anthrax / Couche S / Toxines / Virulence

Abstract

The virulence mechanisms of B. anthracis, the aetiological agent of anthrax, an extracellular, toxinogenic, bacterium, are investigated. Spores of B. anthracis germinate within the phagolysosome of macrophages and toxin expression begins at this step. The structural organisation, the cellular mode of action of toxins and their role in pathogenesis are analysed. The B. anthracis cell surface, the S-layer and capsule, and its role in the interaction of this pathogen with the host is under investigation. It was also shown that B. anthracis can be used to express foreign proteins and is therefore promising for the development of live veterinary vaccines. Genetic studies have shown that B. anthracis and B. cereus are one species.

Key-words: Anthrax / S-layer / Toxins / Virulence

Texte du rapport

Interaction de Bacillus anthracis avec l’hôte

(Chantal Guidi-Rontani - Michèle Mock)

Les mécanismes impliqués dans l’enclenchement de l’infection causée par l’inhalation de spores de B. anthracis ont été étudiés. Nous avons, à l’aide d’analyses en microscopie confocale par immunofluorescence, démontré que le macrophage alvéolaire est le site primaire de la germination de la spore de B. anthracis lors d’une infection par inhalation. Ce phénomène a pu être associé au phagolysosome de la cellule. De plus, des études en cytométrie en image ont montré que la synthèse des toxines commence au sein des macrophages et est donc étroitement couplée avec l’étape de germination. Par ailleurs, nous avons identifié et caractérisé un opéron de germination sur le plasmide de virulence pXO1. Cet opéron est nécessaire à une germination efficace de B. anthracis dans l’hôte et est impliqué dans la virulence de ce pathogène.

Toxines de Bacillus anthracis - Mode d'action

(Fabien Brossier - Chantal Guidi-Rontani - Michèle Mock)

Bacillus anthracis produit deux toxines composées de trois protéines : la toxine létale (PA + LF) est responsable de la mort de l’animal, et la toxine œdématogène (PA + EF) provoque la formation d’un œdème. PA joue un rôle-clé dans la pathogenèse, il est le composant commun qui permet de fixer et de délivrer EF et LF dans les cellules eucaryotes cibles. EF est une adénylcyclase calmoduline-dépendante et LF, une métalloprotéase. Les protéines cellulaires cibles de LF : MAPKK1, 2, 3 ont été identifiées. Nous avons démontré que LF et EF sont transloquées au sein du cytosol des cellules sensibles à partir des vésicules de l’endosome précoce. Cependant, ces deux protéines adoptent des stratégies différentes pour atteindre leur cible. LF est libérée totalement dans le cytosol alors que EF reste associée à la membrane endosomiale. L’analyse de la structure cristallographique de PA définit quatre domaines fonctionnels. Des approches biochimiques et cellulaires ont montré que le domaine 1 permet de fixer LF ou EF et que le domaine 2 intervient dans leur translocation au sein des cellules eucaryotes cibles. Nous avons montré que le domaine 4 est impliqué dans la fixation de PA sur les cellules. De plus, la délétion d’une boucle de 19 acides aminés, située dans le domaine 4, diminue l’efficacité de fixation de PA sur son récepteur d’un facteur 10. Des souches de B. anthracis produisant la protéine PA mutée dans ses différents domaines fonctionnels ont été construites. L’étude de leurs propriétés in vivo indique une corrélation entre les étapes du mode d’action cellulaire des toxines et le processus infectieux. Par ailleurs, une souche isogénique de la souche vaccinale Sterne, produisant les protéines LF et EF génétiquement détoxifiées, confère une protection totale contre une épreuve létale.

Expression d’antigènes hétérologues par Bacillus anthracis

(Fabien Brossier - Stéphane Mesnage - Michèle Mock)

Il a été montré que des souches recombinantes de B. anthracis peuvent induire une réponse protectrice de nature humorale ou cellulaire selon la nature de l’antigène hétérologue exprimé. Plus récemment, des souches ont été construites produisant le fragment C de la toxine tétanique fusionné soit à la partie N-terminale de LF permettant une présentation via l’interaction avec PA, soit au domaine SLH de EA1 permettant un ancrage à la surface de la bactérie. Ces deux modes d’expression de l’antigène hétérologue protègent contre une dose létale de toxine tétanique.

La surface

(Stéphane Mesnage - Tâm Mignot - Agnès Fouet)

Les bacilles isolés d'animaux malades du charbon sont capsulés. La capsule recouvre une couche structurée formant un réseau, appelée couche S. Cependant, capsule et couche S peuvent être synthétisées indépendamment. La couche S est constituée deu deux protéines abondantes, EA1 et Sap. La régulation de la synthèse de ces protéines est en cours d’étude. Sap et EA1 possèdent chacune dans leur région N-terminale, une séquence répétée trois fois. Ce domaine permet l’ancrage des protéines de couche S et de protéines hétérologues, à un polysaccharide associé au peptidoglycane qui doit pour cela être modifié. Ce mécanisme d’ancrage non covalent est retrouvé dans de nombreuses espèces bactériennes.

Approche moléculaire de l’épidémiologie du charbon en France et caractérisation phylogénétique des souches du sol

(Agnès Fouet - Michèle Mock)

Le charbon est une zoonose atteignant tous les mammifères et plus particulièrement les herbivores. Cette maladie de répartition mondiale a considérablement régressé dans les pays occidentaux depuis la fin du siècle dernier. Néanmoins, le charbon existe toujours en France où il apparaît, chaque année, de façon sporadique dans diverses régions. Il existe très peu de données épidémiologiques, et rien au niveau moléculaire, sur le devenir des spores de B. anthracis dans les terres contaminées. Des prélèvements animaux et environnementaux, provenant des foyers répertoriés ces dernières années, ont été étudiés. Nous avons ainsi mis en évidence des Bacillus sp. du sol présentant des caractéristiques biochimiques proches de celles de B. anthracis et de B. thuringiensis (un germe pathogène de l’insecte) mais néanmoins identiques à aucun d’entre eux. Une analyse biomoléculaire plus approfondie impliquant ces bactéries et de nombreux B. cereus a permis de définir que, sur des bases génétiques, B. anthracis, B. cereus et B. thuringiensis sont en fait une même espèce.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

FERRAND Mireille, IP

Chercheurs de l'unité

FOUET Agnès, CNRS
GUIDI-RONTANI Chantal, CNRS
MOCK Michèle, CNRS

Stagiaires de l'unité

BROSSIER Fabien, Doctorant
MESNAGE Stéphane, Doctorant
MIGNOT Tâm, Doctorant
SYLVESTRE Patricia, DEA

Autre personnel de l'unité

AHU Danielle, CNRS
DUFLOT Edith, CNRS
LEVY Martine, IP

Publications de l'unité

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