Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Staphylocoques pour l'année 1999


Responsable : EL SOLH Névine (nelsolh@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les staphylocoques sont les agents étiologiques d'infections bactériennes sévères dont la prévalence est particulièrement élevée en pathologie infectieuse.Les difficultés thérapeutiques résultent de la multirésistance aux antibiotiques des souches hospitalières. L’identification et le typage moléculaire, comme l’étude de la résistance aux antibiotiques, sont des thèmes de recherche liés à l’activité du Centre National de Référence rattaché à l’Unité. La mise en évidence de facteurs pariétaux responsables de l’adhésion au polystyrène et aux protéines de la matrice extracellulaire est un axe de recherche visant à mieux comprendre la physio-pathologie des infections staphylococciques sur prothèse.

Abstract

Staphylococci cause severe bacterial infections. Staphylococcal infections are highly prevalent among infectious diseases. They can be difficult to treat because hospital strains are multiresistant to antibiotics. The research activities associated with the National Reference Center attached to the unit are identification and molecular typing of strains and analysis of resistance to antibiotics. Another research theme is the identification of cell wall factors responsible for adhesion to polystyrene and to proteins of the extracellular matrix. This work will help elucidate the physiopathology of staphylococcal infections of prostheses.

Texte du rapport

Déterminants génétiques de la résistance à la streptogramine A et aux antibiotiques apparentés (J. Haroche, J. Allignet, N. El Solh)

Deux gènes de résistance à la streptogramine A et aux antibiotiques apparentés (pristinamycine IIA, Dalfopristine) ont été caractérisés. L’un d’entre eux est un nouveau gène, sat(G) rebaptisé vat(E), qui code une acétyltransférase inactivant ces antibiotiques et l’autre est un variant de vga(A) qui code une protéine ABC conférant la résistance par un mécanisme non élucidé. Malgré la simitude élevée avec vga(A) (83,2 %), ces deux gènes n’hybrident pas à des températures élevées (* 60°C) en raison de la répartition des divergences sur toute la longueur du gène et des différences dans le contenu en GC de ces gènes (29 % pour vga(A) et 35,6 % pour le variant). Le gène vat(E) et le variant de vga(A) ont été brevetés.

Localisation subcellulaire de la protéine Vga responsable de la résistance à la streptogramine A (O. Chesneau, E. Dassa, N. El Solh)

La protéine Vga est le prototype d’une famille de systèmes ABC (ATP-binding cassette) impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez diverses bactéries. Cette famille ne répond pas au schéma classique d’organisation des transporteurs ABC en ce sens que chacune des protéines de résistance est dépourvue des traditionnels domaines hydrophobes nécessaires à l’ancrage membranaire. La cible ribosomale constitue le dénominateur commun des antibiotiques figurant dans le spectre de résistance. La caractérisation du tropisme cellulaire de Vga doit permettre d’orienter l’étude fonctionnelle vers l’un ou l’autre des deux mécanismes envisagés: protection du ribosome ou efflux actif de la drogue. La purification de Vga en fusion avec MalE a permis de disposer d’anticorps polyclonaux comme outils de détection. Ces derniers ont été utilisés dans des expériences de fractionnement cellulaire menées avec un couple de souches isogèniques de l’espèce Staphylococcus epidermidis. Il y a eu co-sédimentation de Vga avec la sous-unité F1ß de l’ATP synthétase membranaire dans toutes les conditions opératoires testées. Des expériences de microscopie électronique sont en cours pour vérifier le bien-fondé de la localisation membranaire supposée.

Recherche d’adhésines dans les souches de S. caprae responsables d ’infections sur prothèses ostéo-articulaires (J. Allignet, J. Galdbart, S. Aubert, A. Morvan, K. Dyke, N. El Solh)

Un gène codant une autolysine (atlC), l’opéron ica impliqué dans la biosynthèse du biofilm ainsi que deux gènes (sdry, sdrz) codant des protéines « sérine-aspartate » ont été isolés du chromosome d’une souche infectieuse de S. caprae (BM96007) et séquencés. L’ensemble de ces gènes est véhiculé par les 15 souches de S. caprae étudiées (10 souches infectieuses et cinq souches isolées de lait de chèvres indemnes de mammites) mais seulement six souches produisent du biofilm détectable grâce à l’adhésion bactérienne au polystyrène. Une protéine pariétale liant la fibronectine a été décelée dans chacune des souches (175 ou 97 kDa). Le séquençage de la région N-termainale de la protéine de 175 kDa isolée de la souche infectieuse BM96007 suggère que cette protéine correspond à l’autolysine codée par le gène atlC. La purification de l’autolysine AtlC permettra de vérifier si cette protéine est capable de se lier à la fibronectine.

Identification des facteurs de pathogénicité permettant de discriminer les souches de S. epidermidis responsables d’infections ostéo-articulaires sur prothèse des souches commensales (J.-O. Galdbart, J. Allignet, A. Morvan, C. Rydèn, N. El Solh)

Les souches analysées incluaient d’une part, 54 souches infectieuses prélevées de 14 patients et responsables d’infections ostéo-articulaires sur prothèse et, d’autre part, 23 souches de la flore cutanée issues de huit personnes indemnes de toute pathologie. Cette étude a consisté à : - quantifier l’adhésion bactérienne aux plaques de polystyrène recouvertes ou non de protéines matricielles (fibronectine, fibrinogène, collagène), - évaluer la capactié des bactéries à se lier à la sialoprotéine osseuse, - rechercher dans le génome des souches, les séquences qui hybrident à 65°C ou à 42°C, avec les gènes codant des adhésines staphylococciques (atlE, clfA, fnbA, cna, fbe). Le seul marqueur permettant de discriminer les souches infectieuses des souches commensales s’est avéré être l’opéron ica décelé dans 44 des 54 souches infectieuses (81,5 %) et dans quatre des 23 souches de la flore (17,5 %). Il est à noter que la co-présence dans une souche, de ica et de atlE, n’est pas nécessairement liée à la production de biofilm détectable in vitro.

Résistance hétérogène et de bas niveau à la vancomycine parmi les souches de S. aureus isolées en France (O. Chesneau, A. Morvan, N. El Solh)

Des souches de S. aureus résistantes aux traitements par la vancomycine ont été récemment décrites. Elles se répartissent en deux catégories : celles qui sont inhibées, in vitro, par 8 µg/ml de vancomycine et celles qui apparaissent sensibles in vitro (CMI vancomycine * 4 µg/ml) mais dont les cultures comportent des populations bactériennes plus résistantes (CMI vancomycine = 5-7 µg/ml). Dans le cadre des activités du Centre de Référence, nous avons mis au point une technique de détection de cette résistance hétérogène. Celle-ci est basée sur le dénombrement des colonies qui poussent en 24 et 48 h, dans un milieu gélosé « BHIA » contenant 4 µg/ml de vancomycine et ensemencé avec 108 bactéries. Une étude rétrospective a inclus 25 souches de S. aureus représentatives de celles ayant une dissémination épidémique ou endémique en France, depuis 1987. Cinq des vingt-cinq souches étudiées, isolées depuis 1993, exprimaient la résistance hétérogène de bas niveau à la vancomycine. L’une de ces souches, isolée en 1993, avait le même profil de macro-restriction SmaI qu’une souche nosocomiale de S. aureus résistante à la vancomycine (CMI = 8 µg/ml) isolée en France, en 1998. Les souches de ce type sont donc déjà disséminées en France. Il conviendrait de les repérer du fait de leur aptitude à générer des variants exprimant un plus haut niveau de résistance à la vancomycine.

Centre National de Référence des Staphylocoques

Identification et typage des souches, antibiogrammes, recherche de gènes de résistance aux antibiotiques et de gènes codant des facteurs de pathogénicité, préparation et fourniture de suspensions titrées de phages, entretien des collections de souches, expertises, formation de stagiaires.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

TRAN Catherine, IP

Chercheurs de l'unité

CHESNEAU Olivier, IP
EL SOLH Névine, IP

Stagiaires de l'unité

HAROCHE Julien, DEA
GALDBART Jacques, Thèse de Sciences

Autre personnel de l'unité

ALLIGNET Jeanine, IP
AUBERT Sylvie, IP
MORVAN Anne, IP

Publications de l'unité

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