Rapport d'activité de l'unité Signalisation des Cytokines pour l'année 1999

CNRS URA 1961

Responsable : PELLEGRINI Sandra (Fax : +33 1 4061 3305. Tél. : +33 1 4061 3204. e-mail : pellegri@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Le laboratoire s’intéresse aux signaux intracellulaires qui sont déclenchés par la liaison des interférons de type I (IFN alpha et IFN beta) au complexe récepteur/JAK et qui entraînent la phosphorylation d’effecteurs impliqués dans l'induction transcriptionnelle de gènes cibles. Notre travail s’organise principalement autour de l’étude de la protéine tyrosine kinase Tyk2, membre de la famille JAK associée aux récepteurs des IFN alpha/beta et de l’IL-12 et élément essentiel dans les phases précoces de la transmission de signaux. Les projets du laboratoire portent sur l’analyse structure-fonction de Tyk2; l’identification de nouveaux partenaires protéiques de Tyk2 et l’étude de leur fonction; l’étude de la localisation de Tyk2 au sein de la cellule; l’étude du mécanisme régissant le partage de Tyk2 entre le récepteur des IFN alpha/beta et le récepteur de l’IL-12. Nous avons récemment initié une analyse comparative de la réponse transcriptionnelle à l’IFN alpha et à l’IFN beta dans les cellules humaines T naïves et les cellules Th1 et Th2.

Abstract

Our laboratory studies the signal transduction events activated by type I interferons (IFNs alpha and IFN beta) which bind to the receptor/JAK kinase complex, leading to the phosphorylation of downstream effectors involved in the transcriptional induction of target genes. Our work focuses on the study of the tyrosine kinase Tyk2, a member of the JAK family associated with the IFN alpha/beta and the IL-12 receptors and a key element in the control of early signaling steps. The projects include a structure-function analysis of Tyk2; the identification of novel partners of Tyk2 and their functional characterisation; the study of the subcellular localisation of Tyk2; the study of the mechanism controlling the sharing of Tyk2 between the IFN alpha/beta and the IL-12 receptors. Recently, we have initiated a project aimed at comparing the IFN alpha and the IFN beta transcriptional responses in human T naïves and in polarized Th1 and Th2 cells.

Texte du rapport

• Etude du domaine kinase-like de Tyk2 (Tammie C. Yeh, Elisabetta Dondi) Les tyrosine kinases de la famille JAK possède une région amino-terminale, un domaine dit kinase-like ou KL, dépourvu d’activité catalytique, et un domaine à fonction tyrosine kinase. Nous avons entrepris une étude du domaine KL de Tyk2. Par une approche de mutagénèse aléatoire de ce domaine, un panel de mutants ponctuels de type perte de fonction a été obtenu et quatre d’entre eux ont été charactérisés fonctionnellement. Nos travaux démontrent que le domaine KL intervient dans la formation/stabilisation d’un complexe récepteur/kinase à haute affinité de liaison envers le ligand. Aussi, le domaine KL joue un rôle critique dans la régulation de l’activité catalytique de l’enzyme, intervenant dans le maintien de Tyk2 dans une conformation fermée et inactive en l’absence de ligand, ainsi que dans la transition et le maintien de Tyk2 dans sa conformation activée.
• Identification de nouveaux partenaires protéiques de Tyk2 (Michèle Algarté, Tammie C. Yeh) Afin de mieux comprendre le rôle de la portion amino-terminale de Tyk2 et de pouvoir relier Tyk2 à d’autres voies de signalisation, nous avons initié une recherche de partenaires protéiques par l’approche du double hybride chez la levure. L’appât choisi comprend environ 450 acides aminés. A partir d’une banque d’ADNc de la lignée T Jurkat nous avons isolé 11 clones, dont six sont chevauchants. Aucune fonction n’est à ce jour connue pour les six potentiels partenaires de Tyk2 que nous avons identifiés.
• Etude de la phosphorylation de Tyk2 par la caséine kinase II (Mana Oloomi) Un motif optimal de phosphorylation par la Ser/Thr kinase CKII est présent dans la région amino-terminale de Tyk2. L’étude in vivo et in vitro de mutants ponctuels dans ce motif permettra de vérifier si Tyk2 est un substrat de la CKII et de déterminer le rôle fonctionnel de cette phosphorylation.
• Localisation de Tyk2 dans la cellule (Josiane Ragimbeau) Bien que les kinases de la famille JAK se trouvent associées de façon constitutive aux récepteurs de cytokines, il est peu probable que leur localisation au sein de la cellule soit régulée uniquement par cette interaction. Nous avons récemment initié une étude portant sur la localisation de Tyk2 dans les cellules de fibrosarcome humain HT-1080. Nous avons pu mettre en évidence par microscopie à fluorescence une localisation non seulement cytosolique et membranaire, mais aussi nucléaire. Afin de délimiter la région impliquée dans ce transport, nous avons localisé différentes formes mutées de Tyk2 et nous avons démontré que des délétions de la portion carboxy-terminale n’affectaient pas la localisation de la protéine, tandis qu’une délétion à l’extrémité amino-terminale abolissait sa localisation dans le noyau. Le rôle de Tyk2 dans le noyau est à déterminer.
• La réponse aux IFN alpha/beta au cours de la différentiation Th1/Th2 (Elisabetta Dondi) Une étude touchant à la fonction de Tyk2 au sein du récepteur de l'IL-12 est en cours. Nous avons mis au point un système expérimental qui nous permet d’analyser le mécanisme à la base du partage de Tyk2 entre différents récepteurs de cytokines. Ainsi, nous avons démontré qu’il existe une compétition entre le récepteur de l’IFN alpha et celui de l’IL-12 pour l’interaction avec Tyk2. Cette compétition serait responsable de la diminution de la réponse à l’IFN alpha observée suite à expression de la chaîne beta1 du récepteur de l’IL-12. A présent, nous étudions l'interférence entre ces deux voies de signalisation dans des cellules T provenant de cordons ombilicaux humains. A l’aide de la technique de RT-PCR quantitative, les niveaux d’ARNm de gènes induits par l’IFN alpha sont quantifiés dans les cellules naïves et dans les cellules différenciées en Th1 et Th2.

Mots clés : signalisation, cytokines, JAK, tyrosine kinases, interférons, récepteur, interleukine 12

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

HOUSSIN Wendy, IP (whoussin@pasteur.fr)

Chercheurs de l'unité

PELLEGRINI Sandra, Chef de Laboratoire, INSERM (pellegri@pasteur.fr)

Stagiaires de l'unité

ALGARTE Michèle, post-doc (malgarte@pasteur.fr) DONDI Elisabetta, post-doc (edondi@pasteur.fr) OLOOMI Mana, post-doc (oloomi@pasteur.fr) YEH Tammie, post-doc (tyeh@pasteur.fr)

Autre personnel de l'unité

RAGIMBEAU Josiane, ingénieur, CNRS (gragimbe@pasteur.fr)

Publications de l'unité