Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Station Centrale de Microscopie électronique pour l'année 1999


Responsable : GOUNON Pierre (pgounon@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La Station Centrale de Microscopie Électronique est un laboratoire qui s'inscrit dans une logique à la fois de recherche et de service. Il dispose de moyens généraux techniques lui permettant d'aborder une large palette de méthodes de l'analyse ultrastructurale. Le laboratoire travaille en collaboration avec d'autres laboratoires de l'Institut Pasteur sur le thème général "Interactions cellules hôtes pathogènes". Toute une série de travaux ont porté sur les mécanismes d'entrée et de dissémination intracellulaire de deux bactéries Shigella flexneri et Listeria monocytogenes. Des travaux ont porté sur les mécanismes d'adhésion à la surface cellulaire de souches pathogènes d'Escherichia coli. Le laboratoire a étudié les interactions cellules-virus (VIH, cytomégalovirus humain, Ebola). La structure des parois bactériennes ont été analysées ainsi que les protéines exprimées à la surface des bactéries (chez E. coli, B. anthracis et L. monocytogenes). Un rapport plus complet et illustré est disponible à l’adresse : <http: //www.pasteur.fr/recherche/unites/scme/Rapport_1999/Rapport_1999.html> Nous avons introduit récemment des techniques d’analyse ultrastructurale à moyenne et haute résolution. La cryomicroscopie électronique à moyenne et haute résolution, couplée au traitement informatique des images, permet aujourd’hui d'obtenir des informations structurales tridimensionnelles sur des échantillons biologiques hydratés et congelés par accumulation et combinaison des différentes projections de l'objet observé. Ces techniques désormais courantes dans les laboratoires de microscopie structurale possèdent des champs d’applications larges et variés (analyse de la structure fine des protéines, des virus, des complexes nucléo-protéiques). Dans les conditions d’étude structurale à moyenne résolution (15 à 20 Å) sur des molécules isolées, l’observation directe en microscopie à transmission reste limitée à des systèmes biologiques de haut poids moléculaires (PM > 60.000). Cette limitation peut être grandement atténuée (PM > 20.000 en fonction de la protéine étudiée) dans les conditions d’une analyse de cristaux protéiques bidimensionnels par cristallographie électronique. Nous mettons à profit cette expérience pour analyser la structure des macromolécules biologiques et des complexes macromoléculaires (isolés ou en structure cristalline) au sein de la communauté scientifique de l’Institut Pasteur. Cette approche structurale par cryomicroscopie s’avère être tout à fait complémentaire des techniques de résonance magnétique nucléaire ou de cristallographie X, en particulier dans le cas de diffraction électronique à haute résolution sur des cristaux protéiques bidimensionnels (résolution < 10 Å). Il apparaît donc qu’une interaction étroite entre la microscopie à moyenne et haute résolution et ces groupes de bio-structure s’avère indispensable. L’intérêt majeur de cette approche structurale multidisciplinaire en étroite collaboration avec différentes unités de biochimie, biologie moléculaire et cellulaire de l’Institut est de permettre aujourd’hui une meilleure compréhension de la relation structure-fonction des systèmes biologiques étudiés. Si la biochimie classique permet d'accéder à des molécules purifiées, elle ne les produit pas toujours dans des conditions adéquates pour réaliser leur observation et l'analyse fiable et résolutive de leur structure, en particulier en cryomicroscopie. Ainsi, la présence de sels et de détergents sont les plus délétères; la formation d'agrégats l'est aussi. D'autre part, la localisation immunochimique des différents partenaires du complexe macromoléculaire devrait être une source d'informations structurales indispensable pour comprendre son assemblage et sa fonction. Un rapport plus complet et illusté est disponible à l’adresse <http: //www.pasteur.fr/recherche/unites/scme/Rapport_1999/Cryomicroscopie.html>

Texte du rapport

RAPPORT ANNUEL D'ACTIVITÉ SCIENTIFIQUE 1999

La Station Centrale de Microscopie Électronique est un laboratoire qui s'inscrit dans une logique à la fois de recherche et de service. Il dispose de moyens généraux techniques lui permettant d'aborder une large palette de méthodes de l'analyse ultrastructurale. Le laboratoire travaille en collaboration avec d'autres laboratoires de l'Institut Pasteur sur le thème général "Interactions cellules hôtes pathogènes". Toute une série de travaux ont porté sur les mécanismes d'entrée et de dissémination intracellulaire de deux bactéries Shigella flexneri et Listeria monocytogenes. Des travaux ont porté sur les mécanismes d'adhésion à la surface cellulaire de souches pathogènes d'Escherichia coli. Le laboratoire a étudié les interactions cellules-virus (VIH, cytomégalovirus humain, Ebola). La structure des parois bactériennes ont été analysées ainsi que les protéines exprimées à la surface des bactéries (chez E. coli, B. anthracis et L. monocytogenes). Un rapport plus complet et illustré est disponible à l’adresse : <http: //www.pasteur.fr/recherche/unites/scme/Rapport_1999/Rapport_1999.html> Nous avons introduit récemment des techniques d’analyse ultrastructurale à moyenne et haute résolution. La cryomicroscopie électronique à moyenne et haute résolution, couplée au traitement informatique des images, permet aujourd’hui d'obtenir des informations structurales tridimensionnelles sur des échantillons biologiques hydratés et congelés par accumulation et combinaison des différentes projections de l'objet observé. Ces techniques désormais courantes dans les laboratoires de microscopie structurale possèdent des champs d’applications larges et variés (analyse de la structure fine des protéines, des virus, des complexes nucléo-protéiques). Dans les conditions d’étude structurale à moyenne résolution (15 à 20 Å) sur des molécules isolées, l’observation directe en microscopie à transmission reste limitée à des systèmes biologiques de haut poids moléculaires (PM > 60.000). Cette limitation peut être grandement atténuée (PM > 20.000 en fonction de la protéine étudiée) dans les conditions d’une analyse de cristaux protéiques bidimensionnels par cristallographie électronique. Nous mettons à profit cette expérience pour analyser la structure des macromolécules biologiques et des complexes macromoléculaires (isolés ou en structure cristalline) au sein de la communauté scientifique de l’Institut Pasteur. Cette approche structurale par cryomicroscopie s’avère être tout à fait complémentaire des techniques de résonance magnétique nucléaire ou de cristallographie X, en particulier dans le cas de diffraction électronique à haute résolution sur des cristaux protéiques bidimensionnels (résolution < 10 Å). Il apparaît donc qu’une interaction étroite entre la microscopie à moyenne et haute résolution et ces groupes de bio-structure s’avère indispensable. L’intérêt majeur de cette approche structurale multidisciplinaire en étroite collaboration avec différentes unités de biochimie, biologie moléculaire et cellulaire de l’Institut est de permettre aujourd’hui une meilleure compréhension de la relation structure-fonction des systèmes biologiques étudiés. Si la biochimie classique permet d'accéder à des molécules purifiées, elle ne les produit pas toujours dans des conditions adéquates pour réaliser leur observation et l'analyse fiable et résolutive de leur structure, en particulier en cryomicroscopie. Ainsi, la présence de sels et de détergents sont les plus délétères; la formation d'agrégats l'est aussi. D'autre part, la localisation immunochimique des différents partenaires du complexe macromoléculaire devrait être une source d'informations structurales indispensable pour comprendre son assemblage et sa fonction. Un rapport plus complet et illusté est disponible à l’adresse <http: //www.pasteur.fr/recherche/unites/scme/Rapport_1999/Cryomicroscopie.html>

Étude des interactions Shigella flexneri cellules intestinales

Ces travaux ont porté sur les interactions complexes entre les protéines du cytosquelette cellulaire et la bactérie (Ezrine, Vinculine, CD44); sur le trafic du LPS bactérien à travers les cellules épithéliales polarisées. Actuellement, nous nous sommes focalisé sur la structure et la physiologie du complexe de sécrétion de type III de Shigella flexneri.

Structure et rôle du complexe de sécrétion de type III de Shigella dans l'insertion de IpaB et IpaC dans les membranes hôtes (Ariel Blocker, Pierre Gounon, Eric Larquet, Philippe Sansonetti)

Les systèmes de sécréton de type III bactérien servent à la translocation des protéines dans les cellules eucaryotes. Ce système nécessite un "sécreton" et un "translocateur" pour que les protéines puissent passer à la fois les membranes bactériennes et la membrane plasmique de la cellule hôte chez Shigella tous les gènes bactériens nécessaires pour l'entrée de la bactérie dans la cellule-hôte ont été identifiés. Ils sont regroupés dans un "cluster" de 30 kb d'un grand plasmide de virulence. Cette région comprend 2 types de gènes : les gènes ipa et ipg qui codent pour les protéines de l'invasion et leur chaperonnes intra bactériennes et mxi/spa qui code pour les protéines à l'origine de l'appareil de sécréton de type III. Plusieurs des gènes codant pour les sécrétons de type III ont des homologies de séquences avec les corps basaux des flagelles. Récemment, chez Salmonella la structure macromoléculaire du sécréton de type III a été identifiée. Grâce à un procédé original de préparation mis au point spécialement, nous avons pu obtenir la structure du complexe de sécréton de type III de Shigella flexneri. Cette structure tripartite est plus complète que celle obtenue chez Salmonella. En fait, cela semble dû chez Salmonella par une préparation incomplète de cette structure périphérique, le "cou" et le "bulbe" étant masqué par du matériel intracellulaire ce qui n'est pas le cas dans nos préparations de membranes de Shigella. Afin de vérifier que cette structure est vraiment le complexe de sécrétion de type III de Shigella, nous avons observé par la même méthode les mutants de l'opéron mxi. Les mutants mxiD, mxiJ et mxiG ne présentent pas ces structures. Comme ces gènes codent pour les complexes de sécrétion de type III de Shigella, nous avons conclu que les structures tripartites observées correspondent bien aux sécrétons de type III. De plus, nous avons noté qu'il n'y avait pas de différence évidente dans la morphologie des sécrétons chez les mutants ipaB, ipaC et ipaD ainsi que dans leur nombre ou leur répartition à la surface des bactéries. conclu que les modifications de la sécrétion des mutants ipa constaté ne correspondent pas à des anomalies grossières de la structure des sécrétons. Nous n'avons pas encore toutes les données pour comprendre exactement le sécréton et particulièrement sur le rôle des protéines Ipa. Toutefois par cryofracture (données non publiées), nous avons noté l'existence d'un canal central d'environ 3 nm dans l'aiguille du sécréton. Ceci est tout à fait en accord avec les expériences sur le système d'hémolyse mis au point par Ariel Blocker où le diamètre fonctionnel du pore IpaB/IpaC est de 2,2 nm. En couplant nos expériences avec des sondages immunocytochimiques, avec des purifications biochimiques des protéines membranaires bactériennes et des observations à haute résolution des complexes ainsi obtenus, nous pensons pouvoir faire avancer de façon significative la connaissance sur les complexes de sécréton de type III.

Les complexes de sécrétion de type III (Ariel Blocker, Pierre Gounon, Eric Larquet)

Notre découverte de la structure originale du complexe de sécrétion de type III de Shigella flexneri entraîne des analyses poussées sur la nature et la composition du système de translocation, sur la structure fine du complexe, enfin sur le mécanisme d'assemblage de ce complexe. La ressemblance assez étroite du sécréton avec le flagelle bactérien nous a conduit à purifier par des méthodes biochimiques utilisées par ailleurs les complexes de sécrétion. Ces complexes purifiés pourront être examinés par des techniques de cryomicroscopie à haute résolution. Les premières expériences conduites au laboratoire par Eric Larquet sont très encourageantes. De plus, nous avons montré précédemment que les sécrétons sont assemblés avant tout contact avec la cellule hôte. Dans les mutants mxiD, mxiG et mxiJ (gènes qui codent pour des protéines qui sont prédites pour résider dans les membranes interne et/ou externe de Shigella) aucun sécréton n'est délectable ce qui suggère fortement que les composants du sécréton sont dégradés quand la machinerie complète de sécrétion ne peut être assemblée. Ceci est tout à fait en conformité avec le fait que dans les mutants mxiJ et mxiD la protéine MxiG est instable (F. Bahrani et C. Parsot, communication personnelle). Comme nous l'avons montré précédemment le sécréton est composé de 3 parties : 1) une aiguille externe, 2) un cou et 3) un bulbe proximal de grande taille. Dans nos images, il est difficile de discerner les 2 membranes bactériennes et donc de juger de façon pertinente la localisation exacte du bulbe. Néanmoins, les premières mesures faites sur les images de sécrétion indiquent que le cou est de longueur suffisante pour traverser les deux membranes, ce qui suggère que le bulbe est entièrement cytoplasmique. Nous avons commencé des expérience de cryofracture de la surface bactérienne en louant un appareil à Jussieu. Les premières images stéréoscopiques obtenues permettent de confirmer partiellement ce fait. Ceci demande à être complété notamment à l'aide des mutants mxi/spa. Cette partie cytoplasmique n'a pas été décrite chez Salmonella par Kubori et al. (1998) dans les préparations de sécréton purifié à partir d'un protocole utilisé pour l'isolement des bases flagellaires. Une structure cytoplasmique est connue pour être associée avec le flagelle bactérien et qui contiendrait une ATPase cytoplasmique de type F1 (FliI) et de nombreux autres composants. Cette structure que nous avons observée n'est pas retrouvée dans les préparations des corps flagellaires. Nous avons donc un avantage décisif dans ce domaine et nous pensons pouvoir grâce aux mutants de Shigella disponibles comprendre l'assemblage de ce complexe basal. On sait par ailleurs que l'inactivation de Spa47 qui est l'homologue chez Shigella de FliI abolit la sécrétion. Cependant nous sommes encore assez loin de savoir si cette ATPase est nécessaire pour l'assemblage et/ou l'activité de la machinerie de sécrétion. Nous avons déjà montré que les sécrétons de type III de Shigella flexneri sont assemblés avant tout contact avec la cellule hôte et que cette structure ne semble pas profondément modifiée dans sa forme quand la sécrétion est activée (en présence de Rouge Congo ou chez les mutants ipaD et ipaB. Nous avons aussi montré que la sécrétion demande de l'énergie et une température supérieure à 30°C, mais les sécrétons ne disparaissent pas à basse température (4°C). Tous ces éléments rassemblés devraient nous permettre de comprendre à la fois la structure, l'assemblage et le mode de fonctionnement de ce complexe de sécréton de type III. Nous avons une avance considérable sur de nombreux groupes qui travaillent sur ce domaine puisque nous avons un ensemble de méthodes partagé par des laboratoires complémentaires, ce qui nous permettra d'avancer vite dans ce domaine.

Étude ultrastructurale du trafic du LPS de Shigella dans les cellules intestinales polarisées (Pierre Gounon, Jean-Pierre Gorvel, Philippe Sansonetti)

L'épithélium intestinal polarisé possède deux domaines membranaires fonctionnels distincts qui gèrent des forces et des gradients opposés. La surface apicale est baignée de produits microbiens comme le LPS qui a la capacité de stimuler la réponse immune pro-inflammatoire. Les surfaces basolatérales sont au contact d'un système immunitaire composé de cellules résidentes et migratrices qui confèrent à l'ensemble une protection efficace des muqueuses. Un ensemble complexe de signalisation via des cytokines ou des ligands existe entre les domaines apicaux et basolatéraux conduisant à la migration ou à l'interaction des cellules immunitaires au pôle basal de l'épithélium. De plus, des interactions entre les 2 domaines membranaires peuvent survenir par la transcytose vectorielle de molécules à travers la couche cellulaire. Cette transcytose est un système de transport par des vésicules en plusieurs étapes. Après internalisation les fluides, macromolécules et les composants membranaires sont recyclés par un processus encore mal compris au niveau de leur domaine membranaire d'origine. Le matériel qui a été capturé par endocytose peut être trié des endosomes précoces vers les endosomes tardifs puis vers les lysosomes ou vers des vésicules de transcytose pour être délivré vers la face opposée. La raison pour laquelle les molécules se déplacent du compartiment endosome précoce vers la surface cellulaire opposée demeure encore inexpliquée. Le LPS de Shigella flexneri présent sur la surface apicale de l'épithélium polarisé est détecté dans le milieu baso-latéral dans des conditions où l'intégrité des jonctions serrées intracellulaires est maintenue. Nous avons analysé la capture et les voies intracellulaires d'endocytose du LPS afin d'élucider les voies de la transcytose. Cette étude a été faite essentiellement en couplant une analyse au microscope confocal (réalisée au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy) et une étude ultrastructurale. Pour résumer ces observations, le LPS qui est internalisé à la surface apicale (via des vésicules mantelées - "coated pits") est rapidement distribué dans des compartiments endosomaux accessibles à de la transferrine internalisée du pôle basolatéral. Ce compartiment exclu largement les marqueurs de phase fluide qui sont ajoutés à l'un ou l'autre pôle. Une partie du LPS est envoyée vers les endosomes tardifs et le compartiment lysosomial tandis qu'une autre partie du LPS accède aux endosomes basolatéraux qui subissent une exocytose au niveau de l'espace paracellulaire.

Étude comparée des comètes d'actine de Listeria monocytogenes, de Shigella flexneri et de Rickettsia conorii (Edith Gouin, Pierre Gounon, Pascale Cossart, Philippe Sansonetti).

En collaboration avec l'équipe de Pascale Cossart et celle de Philippe Sansonetti, nous avons entrepris une analyse comparative des comètes d'actine et de la mobilité intracellulaire de 3 bactéries pathogènes appartenant à des groupes de micro-organismes différents, non reliés mais qui ont développé de façon indépendante une mobilité liée à l’actine essentielle pour leur dissémination intracellulaire et apparemment similaire. Cette analyse comparée très approfondie a associée notamment de la microscopie confocale à fluorescence et 2 techniques d'analyse ultrastructurale très spécifique de l'actine filamenteuse. L'une de ces méthodes utilise la propriété du sous-fragment S1 de la myosine de se fixer sous les sous-unités de l'actine filamentaire lui conférant une structure en barbelé qui permet d'orienter le microfilament d'actine (côté pointé et côté barbé). Cette technique assez raffinée dans sa mise en œuvre très puissante permet de reconnaître notamment le côté du filament à croissance rapide (côté barbé) de celui à croissance lente ou nulle (côté pointé). La comète de Rickettsia se caractérise par des filaments très longs non ramifiés contrairement à ce qui se passe pour Shigella et Listeria. On peut noter aussi que le mouvement intra-cellulaire de Rickettsia est très lent. Bien que nous ne l'ayons pas analysé, le processus d'assemblage de l'actine pour Rickettsia conorii est aussi différent de celui rapporté par Cudmore et al. en 1996 pour le virus de la vaccine. Pour Shigella et Listeria, les gènes bactériens impliqués dans la formation de la queue d'actine sont bien identifiés. Les généticiens ont essayé d'identifier des équivalents d'ActA et de IcsA chez Rickettsia. Il n'a pas été possible d'identifier un homologue quelconque, nous ne connaissons pas à l'heure actuelle le ou les facteurs impliqués dans la motilité de Rickettsia. En fait, nous ne savons pas bien à l'heure actuelle (mais il s'agit là d'un beau projet à développer dans les mois à venir) si la mobilité intracellulaire de Rickettsia est un réel facteur de virulence. Le genre Rickettsia est divisé en 2 groupes : le groupe de Typhus (TG) qui comprend l'espèce R. Prowazekii très virulente et le groupe "Spotted fever" (SFG) avec R. Conorii et R. rickettsii. R. prowazekii est intracytoplasmique mais ne polymérise pas l'actine. Dans le groupe TG l'espèce pathogène R. typhi polymérise l'actine mais de façon peu extensive. Au contraire dans le groupe SFG, toutes les Rickettsia semblent polymériser l'actine, mais seules quelques unes d'entre elles sont pathogènes. Par exemple, R montana n'est pas pathogène mais a la capacité de polymériser l'actine. Nous pensons qu'il sera extrêmement intéressant et instructif de comprendre le rôle relatif de la polymérisation de l'actine pendant l'infection par ces différentes espèces. Nous avons pratiquement tous les outils et l'expérience pour faire cela.

Recherche méthodologique (Pierre Gounon) Dans le cadre de la mise au point de protocoles permettant de répondre avec précision a un projet financé par un contrat du MRT concernant l'analyse immunocytochimique de l'UMP Kinase de Escherichia coli nous avons amélioré et codifié des procédés d'inclusion à basse température dans des résines acryliques tout en améliorant la qualité structurale et la sensibilité immunocytochimique. Ces procédés ont eu un large écho et ont fait l'objet d'une publication et d'un chapitre d'un ouvrage collectif "Methods" in Molecular Biology, vol. 117 : Electron Microscopy Methods and Protocols.

Localisation et structure de l'UMP Kinase de Escherichia coli et d'autres micro-organismes (Pierre Gounon, Eric Larquet,Octavian Barzu, Hiroshi Sakamoto, Stéphanie Landais)

Les nucléosides monophosphates kinases (NMPK) sont connues dans toutes les cellules vivantes. De petite taille et généralement monomérique, leur structure est bien connue et notamment l'une d'entre elle l'adénylate kinase (AK). L'UMP kinase des bactéries représente une classe particulière des NMPK. La protéine qui est un hexamère (première différence avec les NMPK en général) ne présente aucune similarité de séquences avec les autres NMPK. Son expression est aussi régulée de façon extrêmement complexe. Comme l'expression du gène pyrh est essentiel, l'UMP kinase pourrait être une cible nouvelle pour de nouveaux antibiotiques et de plus elle pourrait avoir des fonctions complexes autre que la catalyse. En l'absence actuellement de données ultrastructurales à haute résolution, l'utilisation des anticorps a permis de répondre à un ensemble de questions concernant la structure et les propriétés catalytique de l'UMP Kinase. En fait, l'un des résultats les plus surprenants de cette étude concerne la localisation dans la bactérie de l'UMP Kinase. L'UMP Kinase a été observée en grande partie sur les membranes de la bactérie (la résolution de l'immunomarquage à l'or colloïdal) et une petite partie ne permet pas de préciser si la protéine se trouve sur l'une ou l'autre membrane ou au niveau de l'espace périplasmique. D'autres analyses tendent à privilégier l'hypothèse que l'UMP Kinase est adhérente à la membrane interne en pavage hexagonal régulier dans le cytoplasme. Ce résultat renforce notre hypothèse du rôle multifonctionnel de cette enzyme dans la vie bactérienne. L'UMP Kinase est purifiée à l'homogénéité. Nous avons déjà entrepris son analyse ultrastructurale à moyenne résolution (2 nm) par contraste négatif et analyse d'images, alignement et moyennage. L'analyse par cryomicroscopie est en cours. Nous avons aussi entrepris la localisation de l'UMP Kinase chez M. tuberculosis (souche Mt103) et prochainement chez B. subtilis dès que les anticorps pour cette espèce seront disponibles. Comme chez E. coli, la localisation de l'UMP Kinase (voir figure) des mycobactéries est essentiellement périphérique. Bien que toutes les preuves ne soient pas encore apportées, on doit penser que le rôle multifonctionnel (catalytique et structural) de l'UMP Kinase est une caractéristique générale des bactéries.

L'entrée de Shigella flexneri dans les cellules hôtes : un processus complexe impliquant des protéines bactériennes, l'actine et plusieurs protéines du cytosquelette (Pierre Gounon, Equipe Philippe Sansonetti)

Ainsi qu'il a été montré depuis longtemps Shigella induitla formation d'extensions membranaires qui sont liées à la polymérisationde l'actine cellulaire sous corticale. Ces extensions s'étendent au-dessus de la bactérie et fusionnent en feuillets membranaires qui emprisonnent la bactérie dans une large vacuole. Ce processus est extrêmement complexe et seule une régulation très fine des réarrangements du cytosquelette induit par la bactérie permet la formation et l'évolution de cette structure hautement organisée que l'on appelle foyer d'entrée (« Entry focus »). Plusieurs protéines du cytosquelette qui participent à l'organisation du foyer d'entrée sont spécifiquement concentrées à ce niveau. Un réseau riche en vinculine a été observé au niveau de la membrane plasmique en contact étroit avec la bactérie formant une structure rappelant les plaques d'adhésion des cellules au substrat. Les feuillets membranaires qui entourent la bactérie au moment du processus d'internalisation sont particulièrement riches en protéines formant des faisceaux. C'est le cas notamment de la plastine et de l'&#61537;actinine. Au maximum du développement du foyer d'entrée, nous avons montré un recrutement massif d'Ezrine (l'Ezrine est une protéine se liant à l'actine et assurant une fonction de liaison entre la membrane et le cytosquelette) au bout des extensions des feuillets membranaires. L'Ezrine assurerait alors l'extension des microfilaments pendant la phase de formation du foyer d'entrée. De la même façon, nous avons montré que le CD44 se lie à IpaB (une des protéines sécrétées par Shigella via le complexe de sécrétion de type III mis en évidence par ailleurs Le CD44 est un membre de la superfamille des immunoglobulines qui lie les groupements hyaluroniques. Cette interaction semble nécessaire pour déterminer les événements précoces de la formation du foyer d'entrée et expliquerait très bien le tropisme particulier de Shigella flexneri in vivo pour les cellules M de l'intestin . Des travaux récents ont montré que IpaA se lie directement à la vinculine, IpaA contrôlerait donc le réarrangement du cytosquelette du foyer d'entrée par l'intermédiaire de la vinculine. Il était intéressant de définir le rôle de l'association entre IpaA, vinculine et actine. Une série d'expériences ont été réalisées par R. Bourdet-Sicard pour caractériser cette association. En complément de ces expériences, nous avons tenté de comprendre et d'observer les différents états de l'actine associée ou non avec IpaA et vinculine en fonction du temps. L'expérience simple dans son principe s'est avérée toutefois délicate à réaliser. Nous avons mis au point un protocole particulier associant contraste négatif et ombrage rotatif de platine/carbone à petit angle qui s'est avéré très performant puisque cela permettait d'avoir à la fois un état dynamique de l'évolution des microfilaments d'actine (la fixation d'un état donné ne demandant que quelques secondes) et l'observation avec un fort contraste, une excellente résolution et surtout un faible grandissement (qui permet l'observation de larges champs) des différents états de l'actine en interaction avec la vinculine et avec IpA. Grâce à cet ensemble de techniques, il a pu être montré que IpaA est un activateur de la vinculine en augmentant la capacité de la vinculine à interagir avec l'actine filamenteuse (cf. schéma ci-dessus). Il a pu être montré aussi que le complexe vinculine IpaA de dépolymérisation des microfilaments d'actine, aussi bien in vitro comme nous l'avons vu en microscopie électronique, que dans des cellules micro-injectées. Ces deux capacités apparemment contradictoires expliqueraient assez bien la modulation induite par IpaA au cours des phases initiales de l'internalisation de la bactérie.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Danièle Lhoumeau

Chercheurs de l'unité

André Topilko
Eric Larquet

Autre personnel de l'unité

Evelyne Tosi-Couture
Jeanne Humbert
Brigitte Chavinier-Jové
Claude Rolin

Publications de l'unité

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