Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Rétrovirus et Transfert génétique pour l'année 1999

CNRS URA 1930


Responsable : Heard Jean Michel (jmheard@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Le laboratoire se consacre à l’étude des mécanismes de l’infection rétrovirale et au développement de stratégies pour la thérapie génique.

Concernant l’infection rétrovirale, nous étudions i) le récepteur PiT-2 qui est la voie d’entrée des rétrovirus murins amphotropes et un transporteur physiologique pour les ions sodium et phosphate, ii) les voies de pénétration et du trafic des particules VIH entrantes dans divers types cellulaires, en particulier dans les cellules présentatrices d’antigène ; iii) les mécanismes de la présentation restreinte par le MHC-I d’épitopes antigéniques portés par les capsides virales qui pénètrent dans les cellules, iv) le trafic intracellulaire des protéines du MHC-I et de ses perturbations induites par Nef.

Le développement de stratégies pour la thérapie génique concerne la distribution de protéine thérapeutiques telles que i) l’apolipoprotéine E3 pour la correction des lésions athéromateuses ; ii) l’érythropoïèse en vue d’un traitement pour les ß-thalassémies ; iii) des enzymes lysosomales pour la correction des déficits génétiques en ces enzymes et en particulier pour la correction des lésions du système nerveux central.

Abstract

Our research programs consist in the investigation of cell infection with retroviruses and in the development of strategies for gene therapy.

With respect to retrovirus entry, we study i) PiT-2, the receptor which mediates infection with amphotropic murine leukemia viruses; ii) the entry pathways of HIV particles in antigen presenting cells; iii) the mechanisms leading to the MHC-I restricted presentation of exogneous HIV antigens generated from incoming virions; iv) the intracellular trafficking of MHC-I molecules and the perturbations induced by the Nef protein of HIV-1.

We are developing gene therapy strategies for the delivery of therapeutic proteins. Studied mouse models include i) the delivery of apolipoprotein E3 and the correction of atherosclerosis lesions; ii) delivery of erythropoietin and its application to the treatment of ß-thalassemias; iii) delivery of lysosomal enzymes for the correction of genetic deficiencies, with a special interest for the correction of the lesions of the central nervous system.

Texte du rapport

Etude des phases précoces de l’infection rétrovirale.

Fixation au récepteur, fusion, entrée, reverse transcription et transport nucléaire sont des étapes communes aux rétrovirus sauvages et aux vecteurs rétroviraux utilisés pour la thérapie génique. Qu’il s’agisse d’oncorétrovirus ou de lentivirus, ces étapes restent mal comprises.

Nous avons poursuivi notre analyse du fonctionnement d’un des récepteurs des oncorétrovirus murins (P. Rodrigues, C. Salaün). PiT-2 permet l’entrée des rétrovirus murins amphotropes. Il fonctionne comme un transporteur pour les ions sodium et phosphate. C’est une molécule à multiples segments transmembranaires. Nous avons précisé l’organisation de PiT-2 dans la membrane, étudié sa glycosylation, son état d’oligomérisation, sa liaison au cytosquelette d’actine et sa phosphorylation. Ces propriétés semblent participer à la régulation de l’activité de PiT-2, aussi bien en regard du transport ionique que de l’entrée virale.

Le VIH infecte les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigène, macrophages et cellules dendritiques. Nous avons montré que les macrophages internalisent les particules virales de manière non spécifiques dans des vésicules intracellulaires de micropinocytose. L’interaction spécifique de l’enveloppe virale avec un co-récepteur conduit à la fusion avec la membrane vésiculaire (V. Maréchal, O. Schwartz), La dégradation des capsides implique probablement le protéasome. Elle génère des peptides qui peuvent rejoindre les molécules de classe I en cours de synthèse et être présentés à des CTL spécifiques (O. Schwartz, collaboration avec F. Buseyne et Y. Rivière). Cette présentation antigénique précoce, en l’absence de néosynthèse des protéines virales, joue potentiellement un rôle important dans la réponse immunitaire antivirale. En effet, comme nous l’avons montré, la reconnaissance ultérieure des cellules infectées est compromise par l’expression de Nef (O. Schwartz). Nous avons poursuivi l’analyse des mécanismes par lesquels Nef diminue l’expression du CMH-1 à la surface cellulaire (S. Le Gall, O. Schwartz). Plutôt que d’accélérer le recyclage des molécules de surface, nous avons montré que Nef perturbe l’adressage du CMH-1 à la surface cellulaire et provoque ainsi sa rétention dans le réseau transgolgien. Une étude des mécanismes moléculaires impliqués est en cours (H. de Rocquigny). Nous étudions en outre le rôle de Nef d’un point de vue virologique et immunologique au cours de la réplication du VIH dans les cellules dendritiques (C. Petit).

Développement de stratégies pour la thérapie génique.

Trois systèmes modèles sont étudiés, dans lesquels l’induction de la sécrétion d’une protéine à partir de tissus génétiquement modifiés est supposée avoir un effet thérapeutique.

La distribution systémique d’apolipoprotéine E3 à partir du foie génétiquement modifié par un vecteur adénoviral nous a permis de montrer une régression de la maladie athéromateuse chez la souris déficitaire (C. Desurmont, collaboration avec RPR Gencell).

La distribution systémique permanente de grandes quantités d’érythropoiétine a été obtenue par une injection unique de vecteur AAV dans le muscle. Le niveau de sécrétion est modulable grâce à la présence d’un promoteur inductible par la tétracycline dans le vecteur, Cette procédure permet l’établissement d’une érythropoïèse fonctionnelle de type fœtal chez la souris thalassémique et une correction définitive de l’anémie hémolytique (D. Bohl, S. Samakoglu). Les mécanismes mis en jeu par l’érythropoiétine ont été élucidés. Cette stratégie est maintenant mise en œuvre chez des macaques normaux dans l’optique d’une application humaine (collaboration avec P. Moullier, CHU de Nantes).

Les maladies de surcharge lysosomale peuvent être corrigées par un apport substitutif de l’enzyme manquante. Pour les maladies lysosomales affectant le système nerveux central, qui sont les plus fréquentes, cet apport ne peut se concevoir que par la sécrétion in situ à partir de cellules génétiquement modifiées. L’injection stéréotaxique de vecteurs AAV ou de vecteurs lentiviraux dans le cerveau permet d’obtenir une telle sécrétion de manière définitive. Nous avons montré dans le modèle de la souris MPS VII que l’enzyme peut être distribuée à l’ensemble du cerveau, conduisant à une correction de la pathologie (A. Bosch, N. Desmaris). Des études chez le chien et le macaque ont été engagées afin de juger de la faisabilité de cette approche chez les enfants atteints (collaboration avec M. Tadié, laboratoire de Neurochirurgie du CHU Bicêtre et avec P. Moullier, CHU de Nantes).

Mots clés : rétrovirus, récepteur viral, VIH, CTL, Nef, CMH-1, cellules dendritiques, thérapie génique, AAV, erythropoiétine, thalassémie, maladies lysosomales, système nerveux central.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Renée Communal, communal@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

Jean Michel Heard, DR1 INSERM, jmheard@pasteur.fr Olivier Schwartz, CR Pasteur, schwartz@pasteur.fr Delphine Bohl, CR2 INSERM, dbobl@pasteur.fr Sylvie Le Gall, CR2 INSERM, slegal@pasteur.fr Nathalie Sol-Foulon, CR2 CNRS

Stagiaires de l'unité

Caroline Petit, cpetit@pasteur.fr
Christine Salaün, csalaun@pasteur.fr
Selda Samakoglu, ssamako@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

Nathalie Desmaris, nchodan@pasteur.fr
Valérie Maréchal, vmarecha@pasteur.fr

Publications de l'unité

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