Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Régulation enzymatique des Activités cellulaires pour l'année 1999

CNRS URA 1773


Responsable : VERON Michel (mveron@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’activité du laboratoire est organisée autour de deux thématiques: l'étude de la différenciation chez Dictyostelium discoideum, et l’étude de la Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP Kinase), une enzyme clé du métabolisme des nucléotides tri-phosphates. La NDP kinase intervient dans la voie d’activation des drogues utilisées dans les thérapies anti-virales et notamment anti-SIDA. Nous étudions aussi la fonction de fixation à l'ADN simple brin qui est spécifique de la NDP kinase de type B chez l'humain, qui est impliquée dans la régulation de l'Oncogène c-Myc.

Abstract

Our research is organized into two main programs: (i) We use Dictyostelium discoideum as a model system to study cell differenciation . (ii) We study Nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) which plays a major role in nucleotide metabolism. NDP kinase is part of the pathway of activation of nucleoside analogues used in anti-viral therapies. We also study at the biochemical and structural levels the single strand DNA binding activity of the isoform B of human NDP kinase which is involved in the regulation of the c-Myc oncogene.

Texte du rapport

  1. LA DIFFÉRENCIATION CELLULAIRE CHEZ DICTYOSTELIUM Les amibes de Dictyostelium discoideum vivent normalement à l'état unicellulaire en se nourrissant de bactéries par phagocytose, s'engagent dans un cycle de différenciation quand elles sont privées d'apport nutritif. Après quelques heures de carence, elles migrent en réponse à des signaux d'AMPc pour former un "agrégat" d‘environ 100,000 cellules, qui est le siège d'une différenciation en pré-spores et pré-tiges pour former un sporange composé d'une tige formée de cellules vacuolées supportant une masse de spores. Mise en évidence d’une voie de signalisation NF-kB chez Dictyostelium discoideum (François TRAINCARD ) La voie de signalisation NF-kB joue un rôle dans le contrôle de nombreux gènes impliqués dans la réponse immune et inflammatoire. Les facteurs de transcription NF-kB interviennent dans la prolifération cellulaire en contrôlant des gènes codant pour des facteurs de croissance et leur récepteurs. Les facteurs NF-kB sont aussi impliqués dans le développement et dans la mort cellulaire programmée. En utilisant des anticorps dirigés contre les facteurs de transcription p65, p50 et p52 et contre l'inhibiteur IkB-b constitutifs du complexe cytosolique NF-kB de souris, nous avons identifié la présence de protéines homologues dans des extraits de Dictyostelium. Nous avons aussi mis en évidence des protéines réagissant avec des anticorps spécifiques des kinases IKK-a et IKK-b appartenant au complexe régulateur de NF-kB chez les mammifères. En utilisant la technique de "retard sur gel" avec des extraits nucléaires de cellules de Dictyostelium carencées pendant 16h (stade limaçon), nous avons mis en évidence la présence de facteurs capables de lier spécifiquement plusieurs oligonucléotides portant des sites consensuels de type kB.

Séquençage du génome de Dictyostelium discoideum : (Carmen BUCHRIESER) (en collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes de l’Institut Pasteur) Le projet de séquençage du génome de Dictyostelium (36 Mb) a été entrepris en collaboration avec plusieurs équipes en Europe et aux Etats-Unis. Le laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes de l'Institut Pasteur (GMP) participe au séquençage du chromosome 6 dans le cadre d’un Consortium financé par l'Union Européenne, coordonné par le Sanger Center (Hinxton, UK). La stratégie choisie comporte deux approches: le séquençage de type shotgun sur le chromosome 6 purifié par champ pulsé et le séquençage d’un nombre limité de clones YAC correspondant à ce chromosome qui est utilisé pour l’assemblage des séquences. Dans un premier temps, 5 clones YAC ont été séquencés dont chacun a une taille moyenne de 180 kb.

LA NUCLÉOSIDE DIPHOSPHATE KINASE

La Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP Kinase) échange un phosphate entre nucléosides triphosphates et nucléosides diphosphates. Le transfert du g-phosphate se fait par un mécanisme de type ping-pong qui comporte un intermédiaire enzymatique phosphorylé sur une histidine. Les NDP Kinases sont responsables de la synthèse de la forme triphosphate des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales et en particulier anti-HIV.

Etude de la phosphorylation des analogues de nucléosides à propriétés anti-virales: Benoit SCHNEIDER, Annett KREIMEYER et Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec l'Unité de Chimie organique de l'Institut Pasteur et avec le laboratoire de Joël JANIN, LEBS à Gif-sur-Yvette)

La NDP kinase présente peu de spécificité pour les nucléotides substrats qui peuvent être des dérivés ribo- ou désoxyribo- de bases puriques et pyrimidiques. Aussi, son étude se place dans le contexte de l'élaboration de médicaments antiviraux, notamment anti-HIV (AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC), anti-herpes (acyclovir) etc.… , la cible étant la DNA polymerase du virus. Ces médicaments sont également à l'étude comme anticancéreux avec pour cible la télomérase cellulaire. Ces analogues à visée thérapeutique sont prescrits sous forme de nucléosides qui sont phosphorylés par des kinases cellulaires. La NDP kinase est responsable de la dernière étape de cette voie menant à la synthèse des analogues triphosphorylés qui sont des substrats de la transcriptase inverse empêchant l'élongation des chaines d'ADN. Nous étudions la cinétique de phosphorylation des dérivés diphosphates. Nous avons montré que le d4T est un bien meilleur substrat pour la NDP kinase que l'AZT et les didéoxynucléotides. La structure du complexe entre la NDP kinase et les analogues, déterminée à haute résolution, fournit une explication au niveau atomique des propriétés biochimiques observées. Par ailleurs, nous tentons de mesurer la contribution de la NDP kinase dans la phosphorylation des analogues antiviraux in vivo en utilisant la levure comme système modèle car elle ne possède qu’une seule NDP kinase. Grâce à une souche mutante où le gène codant pour la NDP kinase a été inactivé, nous comparons l’entrée de l’AZT marqué au tritium et sa phosphorylation en mono- di- et triphosphate dans des levures normales et mutées. A plus long terme, nous tenterons de reconstituer in vitro la voie d’activation des analogues et nous chercherons à mettre en évidence d’autres kinases éventuellement impliquées dans ce processus. L’énantiosélectivité des enzymes catalysant la phosphorylation des analogues de nucléosides est un critère important concernant leur pouvoir antiviral. Des nucléosides-L comme le 3TC ont une excellente activité antivirale et une toxicité moindre que les dérivés D. Nous avons montré que le transfert de phosphate sur des substrats -L est très faible avec la NDP kinase qui apparait comme une enzyme stéréospécifique des nucléotides-D. Il semble donc que la NDP kinase ne soit pas la seule enzyme apte à phosphoryler les nucléotides diphosphates.

Recherche de nouvelles molécules à propriétés antivirales : Benoit SCHNEIDER et Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec Robert SARFATI (Unité de Chimie Organique), Joël JANIN (LEBS, Gif sur Yvette), et Bruno CANARD (Marseille-Luminy)

Nous avons testé avec succès une nouvelle classe d’analogues de nucléotides antiviraux: les dérivés présentant un groupement borano (BH3-) sur le phosphate alpha. Celui-ci présente l’avantage d’être isostructural et isoélectronique à l’oxygène qu’il remplace et confère à la molécule une plus grande résistance aux nucléases. L’introduction d’un groupement borano en alpha crée un centre chiral sur l’atome de phosphate alpha. Les dérivés borano de l’AZT et du d4T sont de meilleurs substrats tant pour la NDP kinase que pour la transcriptase inverse comparé au dérivé non substitué. La structure des complexes avec le dTDP-borano a été obtenue à haute résolution.

Etude du mécanisme de transfert de phosphate: Benoit SCHNEIDER et Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec Joel JANIN à Gif sur Yvette)

Nous avons construit par mutagénèse dirigée plusieurs mutants inactifs de la NDPK où l’His catalytique est remplacée par une Gly (H122G) ou une Ala (H122A). Ces mutants ne catalysent plus l’échange de phosphate entre un NTP et un NDP. Ils facilitent cependant le transfert de phosphate entre l’ATP et un nucléophile exogène comme l’imidazole et présentent une très légère activité d’hydrolyse de l’ATP. L’étude de différents nucléophiles (imidazole, alcools, amines) a permis de mesurer la contribution du positionnement du nucléophile dans le site actif de l’enzyme au cours de la catalyse. L’addition d'un résidu Tryp à l’entrée du site actif du mutant H122G permet de mesurer, en l’absence de catalyse, l’affinité des nucléotides triphosphates naturels et des analogues antirétroviraux. Le d4T-TP, contrairement à l’AZT-TP, se lie à la NDP kinase avec une très bonne affinité, probablement à l’origine de son excellent pouvoir antirétroviral. Nous avons étudié l’état d’ionisation des résidus importants dans le transfert de phosphate, la Lys 16 et la Tyr 56. Les deux résidus sont protonés dans la forme active de l’enzyme et sont en interaction. L’absence de la Lys16 dans le mutant K16A force la Tyr56 à perdre son proton avec un pK anormal de 8,3. Il est notable que le remplacement de ces résidus dits “ catalytiques ” entraînent une diminution d’activité plus faible que l’absence du 3’OH du nucléotide. Récemment, nous avons synthétisé un analogue de l’enzyme phosphorylé en modifiant chimiquement un mutant inactif de la NDP kinase où l’histidine catalytique est remplacée par une cystéine. Nous avons pu introduire en quantité stoechiométrique un groupement thiophosphate relativement stable à la place de la phosphohistidine. L’étude de la liaison des nucléotides substrats montre que cette forme pseudophosphorylée présente une plus grande affinité pour les nucléotides diphosphates que triphosphates. L’obtention de cet analogue d’enzyme phosphorylé va permettre d’aborder l’étude de la dernière étape du cycle catalytique, celle du transfert de phosphate de l'enzyme vers le diphosphate accepteur.

II. LA NUCLÉOSIDE DIPHOSPHATE KINASE : UNE PROTÉINE SE FIXANT AU DNA Etude de la spécificité de la fixation de la NDP kinase sur des oligonucléotides synthétiques : la NDP kinase se fixe sur l’ADN simple brin sans spécificité de séquence (Fabrice AGOU ). (en collaboration avec le laboratoire de J. ROSSIER à l'Ecole de Physique et Chimie de Paris)

Nous avons montré que la NDPK humaine de type B (NDPK-B) s'associe à l'ADN en formant des complexes de haute affinité (KD=40 nM). Les substrats de l'enzyme GDP, ADP, TDP et CDP se comportent comme des inhibiteurs compétitifs de la fixation à l'ADN. L'affinité pour un oligonucléotide est 300 et 5000 fois plus élevée que celles mesurées pour le GDP et le CDP respectivement. L'interaction ADN/protéine a été mesurée par des tests quantitatifs. Nous avons montré que la reconnaissance de l'élément cis-activateur de l'oncogène c-myc par la NDPK-B n'est pas due à une spécificité de séquence mais à une spécificité de structure. En effet, la NDPK-B discrimine fortement le simple brin du double brin d'ADN en se fixant exclusivement sur l'ADN simple brin. Nous avons entrepris de déterminer les sites d'interaction entre la protéine et l'ADN. Des complexes covalents spécifiques ADN/NDPK-B ont été obtenus par irradiation sous laser UV. Après digestion du complexe par des endoprotéases, le motif peptidique interagissant spécifiquement à l'ADN a été isolé et identifié par spectrométrie de Masse de type MALDI TOF. Par ailleurs, des expériences cinétiques conjuguées à celles de fluorescence ont permis de préciser le mode d'association d'un oligonucléotide avec la NDPK-B. Les aptamères sont des inhibiteurs compétitifs pour la réaction catalytique de synthèse des nucléotides triphosphates à partir des diphosphates. L'ensemble de ses résultats permettent pour la première fois de proposer un modèle structural de l'association d'un oligonucléotide à la NDPK-B humaine.

Etude de la spécificité de la fixation de la NDP kinase sur des oligonucléotides synthétiques : la NDP kinase se fixe sur l’ADN simple brin sans spécificité de séquence (Fabrice AGOU , Sharona RAVEH et Stéphane GOFFINONT)

Nous avons montré que la NDPK humaine de type B (NDPK-B) s'associe à l'ADN en formant des complexes de haute affinité (KD=40 nM). Les substrats de l'enzyme GDP, ADP, TDP et CDP se comportent comme des inhibiteurs compétitifs de la fixation à l'ADN. L'affinité pour un oligonucléotide est 300 et 5000 fois plus élevée que celles mesurées pour le GDP et le CDP respectivement. L'interaction ADN/protéine a été mesurée par des tests quantitatifs (filtration sur membrane de nitrocellulose, utilisation des propriétés de fluorescence de la protéine). Nous avons montré que la reconnaissance de l'élément cis-activateur de l'oncogène c-myc par la NDPK-B n'est pas due à une spécificité de séquence mais à une spécificité de structure. En effet, la NDPK-B discrimine fortement le simple brin du double brin d'ADN en se fixant exclusivement sur l'ADN simple brin. Par ailleurs, nous avons entrepris de déterminer les sites d'interaction entre la protéine et l'ADN fixé. Des complexes covalents spécifiques ADN/NDPK-B ont été obtenus par irradiation sous laser UV (en collaboration avec Malcolm BUCKLE). Après digestion du complexe par des endoprotéases, le motif peptidique interagissant spécifiquement à l'ADN a été isolé et identifié par spectrométrie de Masse de type MALDI TOF (en collaboration avec le laboratoire de Jean ROSSIER à l'Ecole de Physique et Chimie de Paris). Par ailleurs, des expériences cinétiques conjuguées à celles de fluorescence ont permis de préciser le mode d'association de l'oligonucléotidique avec la NDPK-B. L'ensemble des résultats permettent pour la première fois de proposer un modèle structural de l'association d'un oligonucléotide à la NDPK-B humaine.

III. AUTRES PROJETS

Etude de la protéine CheY de E. coli: Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec le Laboratoire de Jeff STOCK à Princeton)

La protéine CheY participe à la voie de transduction du signal chimiotactique chez les bactéries. Plusieurs protéines cellulaires sont impliquées, dont une protéine kinase phosphorylée sur une histidine (CheA) qui transfère son phosphate à la protéine " régulateur de réponse " CheY, elle-même phosphorylée sur un aspartate. Che Y peut aussi être phosphorylée par de petites molécules donneurs de phosphate comme l’acétylphosphate ou le phosphoramidate. Dans des expériences de mélange rapide, nous étudions la phosphorylation de CheY ou de mutants de CheY par ces petites molécules en tant que modèle du phosphotransfert.

Etude du facteur NEMO : Fabrice AGOU (en collaboration avec Gilles COURTOIS du laboratoire d'Alain ISRAEL ).

La protéine NEMO a été clonée dans le laboratoire voisin d'Alain ISRAEL, et nous avons participé à sa caractérisation biochimique. C'est une des composantes du complexe de kinase IKK impliqué dans la phosphorylation de l'inhibiteur IkB-a. Le rôle de NEMO dans l'activation des kinases IKK-a ou IKK-b reste encore à élucider. Nous examinons l'hypothèse selon laquelle NEMO agirait comme une protéine "chaperon" spécifique du complexe de kinases IKK. Son mode d'action consisterait à potentialiser la dimérisation de la kinase IKK-b, contribuant ainsi à la formation du complexe IKK requis dans la voie d'activation de NF-kB. Dans un premier temps, nous allons analyser par ultracentrifugation analytique la reconstitution du complexe de kinase IKK à partir des 3 partenaires purifiés isolement IKK-a, IKK-b, et NEMO. Dans un second temps, il s'agira d'étudier si NEMO renforce la dimérisation de la kinase IKK-b dont les interactions directes protéine/protéine ont déjà été démontrées par co-immunoprécipitation.

MOTS CLÉS
Dictyostelium ; signal transduction; phosphorylation; NDP kinase; tumeurs; DNA binding: analogue de nucléosides. *

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Goisnard Christiane

Chercheurs de l'unité

Véron Michel, CNRS et IP
Agou Fabrice, IP
Deville-Bonne Dominique, Paris VI

Stagiaires de l'unité

Kreimeyer Annett, Post-doc
Mesnildrey Sébastien,Post-doc
Raveh Sharona, Etudiante en thèse
Schneider Benoit, Etudiant en thèse

Autre personnel de l'unité

Traincard François (Ingénieur IP)
Giacomoni-Fernandes Véronique (Technicienne IP) Cortes Marie-Thérèse (Aide de laboratoire IP)

Publications de l'unité

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