Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Programmation moléculaire et Toxicologie génétique pour l'année 1999

CNRS URA 1444 (affiliée à l?INSERM)


Responsable : Maurice HOFNUNG (Tel : 01 45 68 88 30 Fax 01 45 68 88 34 mhofnung@pasteur.fr ) (mhofnung@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité de Programmation Moléculaire et Toxicologie Génétique a quatre axes principaux de recherche. Deux axes dérivent de l?étude d?une région génétique complexe de la bactérie modèle Escherichia coli K12 (la région malB). Le premier de ces axes est l?étude de séquences d?ADN répétées et dispersées sur le chromosome bactérien et découvertes initialement en malB. Le deuxième est l?étude de l?organisation, du fonctionnement, des interactions, et de la biogenèse des protéines d?un transporteur trans-membranaire qui appartient à une famille génétique très répandue dans tout le monde vivant. Le troisième axe concerne les super-intégrons bactériens constitués par des suites de gènes mobiles du chromosome. Le quatrième axe aborde les effets sur les bactéries, et plus récemment sur les souris transgéniques, des agents capables de créer des dommages dans le matériel génétique, les agents génotoxiques.

Abstract

The « Unité de Programmation Moléculaire et Toxicologie Génétique » has four main research axes. Two of the axes derive from the study of a complex genetic region of the model bacteria Escherichia coli K12 (the malB region). The first of these axes is the study of repeated DNA sequences dispersed on the bacterial chromosome and which have been discovered initially in the malB region. The second axis is the study of the organisation, the functioning, the interactions and the biogenesis of the proteins from a transporter which belongs to a genetic family widely found in the living world. The third axis deals with super-integrons which are constituted by a chain of contiguous mobile genes in the chromosome. The fourth axis deals with the effects of bacteria, and more recently on transgenic mice, of agents able to create damage to the genetic material, the so-called genotoxic agents.

Texte du rapport

Premier thème. BIME, Séquences répétées et génome. (Jean Marie Clément, Sophie Bachellier, Caroline Wilde, Muguette Jehanno, Patricia Lambert). La structure des chromosomes bactériens est encore mal connue, bien que plusieurs génomes aient été entièrement séquencés. Des séquences répétées, habituellement décrites chez les eucaryotes, sont également présentes en abondance chez les procaryotes. Outre les prophages, les transposons et les séquences d'insertion, des exemples de plus en plus nombreux viennent confirmer cette observation, et nous avons entrepris une analyse informatique systématique des génomes récemment séquencés pour mettre en évidence de nouvelles familles de séquences répétées entre les gènes. La fonction de ces séquences reste à ce jour hypothétique. Nous avons émis l'idée que certaines d'entre elles permettraient de structurer le chromosome en s'associant à des protéines. Nous étudions plus particulièrement les BIME (Bacterial Interspersed Mosaic Elements), famille de séquences répétées extragéniques que nous avons dévouvertes chez E. coli et d'autres entérobactéries voisines, et dont la structure en mosaïque répond à une organisation précise. Nous avons développé une base de données consacrée à ce type de répétitions bactériennes, consultable à l?adresse suivante: http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/. Nous cherchons à élucider la fonction des BIME chez E. coli, notamment par l?identification de protéines s?y fixant. Trois ont déjà été identifiées, dont une chez nous, et pour en trouver d?autres, nous développons la technique du simple hybride chez la levure : des BIME de différentes structures ont été insérées dans un chromosome de levure, et des protéines de E. coli interagissant avec ces séquences ont été sélectionnées dans ce contexte par un crible fonctionnel. Nous allons poursuivre cette analyse par des tests d?interaction in vitro. Une étude comparative des régions intergéniques d'isolats naturels d'E. coli a révélé l'existence d'une nouvelle séquence d'insertion (IS1397) qui semblait s'insérer spécifiquement dans les Unités Palindromiques (UP), l'un des motifs de base constitutifs des BIME. La mise au point d'outils génétiques appropriés a permis de sélectionner des événements de transposition d'IS1397. Nous avons montré que la surexpression de la transposase est toxique (filamentation des cellules et désagrégation du nucléoïde). Des mutants résistants peuvent être isolés et sont en cours de caractérisation. La transposition, qui ne nécessite pas la protéine RecA, se produit avec une spécificité quasi absolue au niveau des UP, chez E. coli et Klebsiella pneumoniæ. La transposition se fait à partir d'un plasmide donneur sur le chromosome, mais pas sur un autre plasmide cible recombinant portant des UP. Il semble donc que la transposase vise des structures présentes sur le chromosome, mais absentes ou non fonctionnelles sur le plasmide cible et suggère que la transposase ne reconnaît pas directement les UP, mais peut-être des protéines qui s'y fixent. Tous ces éléments tendent à conforter notre hypothèse initiale d'un rôle des BIME dans la structure du chromosome. Des études sont en cours pour identifier des protéines qui se lient à la transposase d'IS1397 (double hybride chez la levure et étude de mutants résistants à l'action toxique de la transposase).

Deuxième thème. Le complexe MalFGK2 du transporteur ABC du maltose et l'analyse phylogénétique des système ABC (Elie Dassa, Philippe Bouige, Michaël Mourez, Wolfgang Koester, Maria-Isabel Tapia , Muguette Jéhanno) En partie grâce à nos travaux, ce complexe est un des transporteurs ABC dont le fonctionnement est le mieux connu. On connaît environ 1500 systèmes ABC actuellement recensés dans les banques de séquences. Ces systèmes couplent directement l?énergie d?hydrolyse de l?ATP à une très grande variété de processus biologiques incluant le transport de molécules, la régulation de l'expression génétique et la réparation de l'ADN. Ils possèdent en commun un module protéique « énergétique » d?environ 220 résidus appelé domaine ABC et qui est porté ici par la protéine MalK. Ce module est capable de fixer et d?hydrolyser l?ATP. Nous cherchons à comprendre le mécanisme fonctionnel de la translocation dépendante de l?ATP du maltose dans le cytoplasme ainsi que les règles d?assemblage du complexe MalFGK2. a) Interactions entre MalF, MalG et MalK (Michaël Mourez, Muguette Jéhanno) Nos principaux résultats concernent une région hydrophile que nous avions découverte il y a quelques années, nommée région EAA en référence à certains résidus qu?elle contient. Cette région est conservée dans MalF et MalG mais aussi dans toutes les protéines hydrophobes des systèmes ABC d?import. Nos travaux récents ont contribué à démontrer qu?elle constitue probablement le site majeur de fixation pour l?ATPase des systèmes ABC. En effet, les mutations isolées dans cette région affectent la localisation cellulaire de MalK sans modifier la stabilité globale ni l?insertion dans la membrane des protéines touchées. MalK normalement liée à la membrane cytoplasmique par l?interaction avec MalF et MalG est retrouvée dans la fraction soluble cytoplasmique. A partir de ces mutants EAA nous avons isolé des suppresseurs capables de restaurer le transport et localisés dans le gène malK. La restauration du transport est accompagnée de la restauration de la localisation membranaire normale de la protéine MalK dans les mutants où elle était devenue cytoplasmique. Ces suppresseurs sont localisés dans une région de MalK appelée domaine hélical trouvée dans toutes les ATPases ABC. Ces travaux constituent la première preuve expérimentale de l?existence d?interactions entre la région EAA des protéines hydrophobes et la région hélicale des ATPases des transporteurs ABC. Nous avons étudié l?organisation fonctionnelle du complexe MalFGK2 par une approche biochimique. En incubant la protéine MalK purifiée avec des vésicules à la topologie inversée qui contiennent MalF et MalG surproduits en l'absence de MalK, nous avons pu reconstituer un transporteur fonctionnel. En utilisant cette méthode nous avons montré que la fixation de l'ATP et son hydrolyse modulent l'interaction entre MalK et MalF-MalG. La fixation de l'ATP induit un changement de conformation de MalK, et un site de son domaine hélical devient accessible à la protéolyse. Ce site est protégé de l'attaque de la protéase par la présence de MalF et MalG, ce qui confirme que le domaine hélical est impliqué dans les interactions avec MalF et MalG. Tout récemment, nous avons produit des dérivés fonctionnels de MalF, MalG et MalK dépourvus de cystéines. En introduisant des cystéines par mutagenèse dirigée dans les régions EAA de MalF et MalG d?une part, et dans le domaine hélical de MalK d?autre part, nous avons montré que ces résidus pouvaient être pontés à l?aide de réactifs homo-bifonctionnels spécifiques des cystéines. De plus, la distance entre les cystéines de la région EAA et celles du domaine hélical varie quand on effectue l?expérience en présence d?ATP. Ces résultats montrent que la région EAA est en contact direct avec le domaine hélical de l?ATPase et que la fixation et/ou l?hydrolyse de l?ATP se traduisent par un changement de conformation du transporteur. Ce changement de conformation pourrait être à l?origine de la translocation du substrat dans le cytoplasme. b) Insertion du transporteur dans la membrane cytoplasmique (Michaël Mourez, Wolfgang Koester) Nous avons montré que l'insertion de MalF surproduite dans la membrane sans MalG induit une réponse de stress extracytoplasmique du type "réponse de choc thermique". Une grande boucle périplasmique de MalF en est la cause et la présence de MalG abolit cette induction. Ceci suggère que l'interaction entre MalF et MalG joue un rôle important dans le repliement correct de MalF et la soustrait à un système de contrôle de qualité. Récemment, nous avons montré que cette réponse de choc thermique passe par la voie de signalisation CpxA-CpxR, un couple senseur-régulateur à deux composés impliqué dans la détection de protéines mal conformées dans la membrane externe de E. coli. Nos résultats suggèrent donc que ce système intervient aussi dans la détection de protéines mal repliées dans la membrane cytoplasmique. c) Analyse fonctionnelle de la protéine MalF (Maria-Isabel Tapia) Par une méthode de mutagenèse aléatoire in vitro, nous avons établi une carte des régions fonctionnellement importantes de la protéine MalF. Nous avons identifié deux régions hydrophiles dont la modification n?entraîne pas ou peu de conséquences sur la fonction de MalF. Les boucles cytoplasmiques C2 et C5, la boucle périplasmique P4 et le segment transmembranaire TM8 sont probablement impliqués dans la voie de translocation du substrat. En plus de la région EAA, la boucle cytoplasmique C3 pourrait constituer un site d?interaction secondaire pour la protéine MalK. d) Evolution des systèmes ABC (Elie Dassa, Philippe Bouige) Nos études sur l?évolution des ABC nous a conduits à des données phylogénétiques remarquables, puisqu?elles s?interprètent en disant que les systèmes de transport ABC appartiennent à deux branches distinctes suivant qu?ils sont importateurs ou exportateurs. Ainsi on peut imaginer que la ségrégation entre importateurs et exportateurs a eu lieu dans la cellule primordiale. Enfin, la comparaison des arbres phylogénétiques des protéines intégrales de membranes de ces transporteurs avec celui des cassettes ABC, et celui des protéines affines a montré qu?ils étaient congruents et que ces différents éléments avaient ainsi sans doute co-évolué. Actuellement, nous avons entrepris d?identifier, de classer et de reconstruire les systèmes ABC de tous les êtres vivants. Sur la base de notre classification des systèmes ABC, nous établissons actuellement une base de données qui exploitera les résultats de notre analyse. Une page web http://www-alt.pasteur.fr/~elidassa/ABC_class.html, présente nos premiers résultats.

Notre troisième axe de recherche vise à identifier les fonctions des gènes constituant les super-intégrons ainsi que les mécanismes du recrutement et de l?insertion de ces gènes (Didier Mazel, Anne-Marie Guérout, Dean Rowe-Magnus, Latefa Biskri, Pascaline Ploncard). Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel pour l?évolution des bactéries. On trouve de nombreux exemples, allant de l?acquisition de nouvelles capacités métaboliques à l?expression de nouveaux facteurs de virulence chez les pathogènes, pour illustrer cette observation. C?est toutefois très vraisemblablement dans l?émergence et le développement des multi-résistances au cours de la dernière moitié de ce siècle, que l?on trouve l?illustration la plus frappante et peut-être la plus préoccupante de l?importance de ces échanges génétiques. Dans ce phénomène global, la contribution d?une classe particulière d?éléments mobiles, les Intégrons, a été primordiale chez les bactéries à Gram négatif. Les intégrons constituent un véritable système de génie génétique naturel, dévoué à la capture et la dissémination d'ADN exogène. Nous avons montré l?existence d?une catégorie moins spécialisé d?Intégrons, les super-intégrons chromosomiques, qu?on trouve chez plusieurs genres bactériens appartenant aux protéobactéries (Vibrio, Shewanella, Xanthomonas, Pseudomonas, ...). Leurs relations phylogénétiques laissent penser que ces structures dérivent d'un intégron hébergé par le génome de l'ancêtre commun à ces genres bactériens. Ainsi ce système joue et aurait joué un rôle de machine évolutive pendant des centaines de millions d'années. Actuellement, ces structures maintiennent un réservoir considérable de fonctions adaptatives variées (fonctions métaboliques, résistance, detoxification, virulence...). De plus, ce système semble capable de capturer des gènes d'origine extrêmement diverse, puisqu'on y trouve des gènes qui n'ont d'homologues décrits que chez des eucaryotes, des archaebactéries ou des virus. Nos études suggèrent que c?est dans ce groupe d?éléments qu?est l?origine des intégrons multi-résistants et de leur cassettes de résistance aux antibiotiques. Nos travaux portent sur les aspects suivants: l'inventaire de ces éléments et des fonctions qu'ils hébergent, l'expression des gènes à l'intérieur de ces structures, les mécanismes de recombinaison des cassettes de gène et le processus de genèse des cassettes (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/integ/index.html).

Quatrième thème. Effets mutagènes d?agents de l?environnement. (Philippe Quillardet, Eliette Touati, Xavier Arrault, Valérie Michel).

Le groupe de Toxicologie génétique participe à la démarche préventive qui consiste à détecter les produits de l?environnement (les toxiques génétiques) capables d?altérer le génome de nos cellules (effets génotoxiques) et donc susceptibles d?y créer des mutations et être à l?origine de l?apparition de cancers chez l?homme.

Nous avons utilisé les effets génotoxiques de la cellule bactérienne, pour créer un test de dépistage des agents potentiellement mutagènes et/ou cancérogènes: le SOS chromotest. Ce test permet d'évaluer rapidement, de façon colorimétrique, l'aptitude d'un agent à endommager l'ADN. Il a été validé sur un grand nombre de substances (voir : http://www.pasteur.fr/units/pmtg/). D'autre part, il a été perfectionné pour élargir le champ de son usage et en faire un outil de recherche très simple sur le mode d'action chimique des agents génotoxiques. Il est suffisamment simple pour être automatisé et peut être aujourd?hui utilisé en routine dans le contrôle des produits.

Nous nous intéressons aussi au mécanisme d?action d?agents génotoxiques. Nous avons tout particulièrement étudié le mécanisme d?action d?un mutagène extrêmement puissant chez les bactéries, un nitronaphtofuranne le R7000, représentant d?une famille chimique, les 5-nitrofurannes, couramment utilisés en médecine humaine comme anti-parasitaire et anti-bactérien.

Notre objectif est d?expliquer en termes d?interactions moléculaires pourquoi le R7000 atteint des valeurs record de pouvoir mutagène. Nous avons localisé les dommages qu?il crée au niveau de l?ADN de la bactérie Escherichia coli et les mutations qui en résultent. Nous avons trouvé que le R7000 générait avec une très grande efficacité des adduits à l?ADN. Les adduits formés étaient dans presque tous les cas des guanines modifiées. Il en résulte principalement des substitutions de paire de base G:C --> T:A et des délétions d?une paire de base G:C. Ces molécules de nitrofurannes doivent leur activité génotoxique à leur activation métabolique catalysée par des nitroréductases. Au cours de ce processus, le R7000 entraîne un stress oxydatif, soxRS-dépendant. Il s'agirait là d'un effet secondaire de ce composé mais qui pourrait illustrer une partie de sa génotoxicité.

Les effets de cette même molécule, sont aussi étudiés sur un modèle animal pour permettre de créer un lien plus direct entre les résultats obtenus chez les bactéries et ceux obtenus chez l?animal et nous donner ainsi les éléments pour l?extrapolation des résultats à l?homme. Nous avons utilisé des souris transgéniques c?est-à-dire présentant dans tous leurs chromosomes un gène étranger. Il s?agit ici d?un gène bactérien, le gène lacI, qui sert de rapporteur des effets mutagènes du produit. Il est ainsi possible de déterminer les organes de la souris qui sont la cible de cette action mutagène. Nous avons trouvé que le produit induit des mutations essentiellement au niveau des organes du système digestif: petit intestin, caecum et colon. Les organes digestifs sont le lieu de l?action thérapeutique des nitrofurannes.

Le spectre de mutations induites par le R7000 chez la souris a été déterminé. Il est très similaire à celui qu?il induit chez E. coli. Ce résultat suggère que le mécanisme de l?action génotoxique du produit est très similaire chez ces deux organismes. Toutefois, il semble que le R7000 soit un mutagène beaucoup plus efficace chez la bactérie que chez la souris.

Afin de savoir si les résultats que nous avons obtenus sur le R7000 sont généralisables à l?ensemble de la famille des 5-nitrofurannes, nous envisageons d?examiner le mécanisme de la génotoxicité d?autres produits de cette famille.

Une autre étude menée dans le laboratoire vise à examiner pourquoi certaines maladies d'origine bactérienne peuvent à long terme évoluer en cancer. Les mêmes souris transgéniques sont un très bon outil pour évaluer si des mutations directement liées à l'infection bactérienne peuvent être responsables de ces cancers. Le modèle choisi est celui de l'infection par Helicobacter pylori, bactérie responsable des ulcères gastriques (en collaboration avec l?Unité dirigée par Agnès Labigne). Ces dernières années, les arguments en faveur du rôle étiologique de cette bactérie dans le développement des cancers gastriques se sont accumulés. La question que nous posons est de savoir si une infection chronique chez la souris peut être à l'origine d'une augmentation de la fréquence de mutagenèse au niveau de l'estomac de ces animaux, et pourrait être à l'origine de l'apparition de tumeurs gastriques et constituer ainsi un modèle pour l'étude de cette maladie.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

COVA-RODRIGUES Ana, IP acova@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

BACHELLIER Sophie, IP
CLÉMENT Jean-Marie, CNRS
DASSA Elie, INSERM
GUEROUT Anne-Marie, CNRS
MAZEL Didier, IP
QUILLARDET Philippe, IP
SZMELCMAN Sévec, CNRS

Stagiaires de l'unité

ARRAULT Xavier, En thèse de Pharmacie
BISKRI Latéfa, En thèse
LAURENT David, En maîtrise
LE NOANE François, Ecole d?Ingénieur
MOUREZ Michaël (en stage post-doctoral) PLONCARD Pascaline, Ecole d?Ingénieur ROSSIGNOL Tristan, En DEA
ROWE-MAGNUS Dean, en stage post-doctoral WILDE Caroline, En thèse

Autre personnel de l'unité

TOUATI Eliette, IP
PELLEGRINI Olivier, CNRS

BOUIGE Philippe, IP
IRBY Marie-Louise, IP
JEHANNO Muguette, IP
LAMBERT Patricia, IP
MICHEL Valérie, IP

ARCHAMBEAU Chantal, IP
LEBON Marie Josèphe, IP
MAUVE Evelyne, IP
PRELOT Daniel, IP

Publications de l'unité

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