Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Pathogénie microbienne moléculaire pour l'année 1999

INSERM U 389


Responsable : SANSONETTI Philippe (psanson@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Notre Unité étudie les bases moléculaires, cellulaires et tissulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction de la barrière intestinale par les microorganismes pathogènes et les mécanismes de défense contre ces infections. Nous identifions les gènes microbiens et leurs produits modifiant le comportement des cellules épithéliales ou phagocytaires de l’hôte en interagissant avec des cibles (récepteurs) extra- ou intra-cellulaires induisant des signaux pathologiques chez cette cellule hôte. Le résultat en est l’internalisation des microorganismes dans ces cellules, le mouvement dans les cellules ou les tissus, l’induction de puissants signaux pro-inflammatoires aboutissant à la rupture de la barrière intestinale et à la destruction tissulaire. L'impact de cette réponse innée dominée par l'inflammation aiguë sur la nature et la qualité de la réponse spécifique sont étudiés. Une application de ces études est le développement de vaccins. Deux modèles sont analysés : la shigellose, ou dysenterie bacillaire, et l'amibiase, ou dysenterie amibienne.

Abstract

Our research Unit is engaged in studying the molecular, cellular and tissular bases of invasion of the intestinal epithelial barrier of the colon by bacterial pathogens such as Shigella and protozoan parasites such as Entamoeba histolytica. We are also studying the protective immunity against these pathogens and, as an application, we develop vaccine strategies against invasive pathogens.

Texte du rapport

Bases moléculaires, cellulaires et tissulaires de l'invasion de l'épithélium intestinal par Shigella flexneri Nous avons, par l'utilisation conjuguée de la génétique moléculaire, de la biologie cellulaire et l'analyse de modèles animaux d'infection, identifié les principaux gènes et produits responsables de l'invasion des cellules épithéliales par S. flexneri. Ce travail peut se résumer en trois parties principales.

Entrée de Shigella dans les cellules de l'épithélium intestinal (Chercheurs statutaires : Claude Parsot, Guy Tran Van Nhieu, Philippe Sansonetti Post-doctorants : Ariel Blocker, Maria Mavris, Kirsten Niebuhr, Régis Tournebize Doctorantes : Anne Laure Page, Raphaëlle Bourdet-Sicard) Nous avons, en collaboration avec le groupe de P. Glaser et F. Kunst, séquencé et annoté l'ensemble du plasmide de virulence de 220 kb de S. flexneri qui comporte l'essentiel des gènes nécessaires à l'invasion. Nous avons continué à identifier et caractériser les gènes de Shigella codant pour les protéines responsables de l'entrée de la bactérie dans les cellules épithéliales (protéines Ipa et IpgD) et ceux codant pour l'appareil de sécrétion de type III Mxi-spa qui s'assemble à la surface de la bactérie et permet, au contact de la cellule cible, la sécrétion des protéines Ipa. Nous avons en particulier démontré que IpaC était responsable de la polymérisation de l'actine nécessaire à la formation du foyer d'entrée, que IpaA assurait la maturation du foyer d'entrée grâce à son activité activatrice de la vinculine et de dépolymérisation de l'actine, que IpgD était une phosphatidyl-Inositol (4,5) phosphatase impliquée dans le contrôle de la plasticité de la surface cellulaire. Ces protéines, IpaB et IpaD, et une quinzaine d'autres sont sécrétées via l'appareil de sécrétion de type III que nous avons pu identifier en microscopie électronique en collaboration avec la Station Centrale de Microscopie Electronique et dont nous étudions maintenant les composants et leur organisation par plusieurs méthodes incluant de double-hybride. Nous avons aussi identifié certains des signaux principaux que les protéines Ipa déclenchent à la surface de la cellule épithéliale, entrainant des modifications massives de son cytosquelette qui permettent l'entrée de la bactérie. Le rôle des petites GTPases de la famille Rho et de Src a été démontré et analysé en détail.

Mouvement intracellulaire et passage de cellule à cellule (Chercheurs statutaires : Guy Tran Van Nhieu, Claude Parsot, Philippe Sansonetti Post-doctorant : Michelle Rathman
Doctorant : Coumaran Egile)
Nous avions montré que la bactérie utilisait l'actine de la cellule pour se propulser dans le cytoplasme et envahir des cellules voisines. Nous avons identifié les gènes bactériens et les produits responsables de ce processus et analysons les mécanismes moléculaires de polymérisation de l’actine assurant cette énergie pour la propulsion du microbe. Nous avons démontré, en collaboration avec M.F. Carlier (CNRS, Gif), que la nucléation et la polymérisation de l'actine était dues à la liaison de N-WASP (une cible physiologique de la petite GTPase Cdc42 induisant des structures filopodiales) à IcsA, la protéine de surface de Shigella impliquée dans le mouvement actine-dépendant. Cette liaison, de façon indépendante de Cdc42, permet l'association à N-WASP du nucléateur Arp2/3. Ce complexe ternaire amène nucléation et polymérisation de l'actine. Nous avons enfin démontré que la sécrétion des protéines IpaB et IpaC était essentielle à la lyse de la protrusion formée par la bactérie lors de son passage d'une cellule à l'autre. Nous étudions aussi les mécanismes moléculaires permettant l'engagement de la bactérie dans le complexe jonctionnel et son passage de cellule à cellule dans le contexte d’un épithélium polarisé. Un rôle prédominant de la myosine II dans le processus a été identifié et analysé.

Inflammation et invasion de la barrière intestinale (Chercheurs statutaires : Armelle Phalipon et Philippe Sansonetti Post-doctorants : Dana Philpott, Jonathan Edgeworth) Nous étudions les mécanismes par lesquels Shigella, en engageant les composants effecteurs de l'immunité innée, assure la subversion de la barrière intestinale et son invasion. Ceci se fait par un va et vient entre modèles cellulaires et modèles d'infection intestinale chez l'animal. Les mécanismes moléculaires et cellulaires de l'inflammation qui déstabilise et détruit l'épithélium sont plus particulièrement étudiés. Nous avons démontré le rôle essentiel de CD14 dans la reconnaissance de la présence bactérienne via son LPS et la mise en place des mécanismes précoces de défense. Nous avons aussi démontré le rôle essentiel de Caspase 1 dans la mise en place de la réponse inflammatoire aiguë précoce et de l'engagement antiinfectieux via l'IFNg.

Immunité intestinale spécifique au cours de la shigellose (Chercheur statutaires : Armelle Phalipon Post-doctorant : Véronique Marcel)
Dans des modèles de shigellose expérimentale, nous analysons les mécanismes de la protection médiée par les IgA sécrétoires. Nous avons confirmé que la réponse spécifique de l'antigène somatique polyosidique (LPS) était la seule significativement protectrice. Nous avons démontré le rôle important de la pièce sécrétoire dans l'efficacité protectrice des IgA. La modélisation des épitopes constitutifs de l'antigène est en cours, en collaboration avec Laurence Mulard. Des mimotopes peptidiques de ces épitopes ont été obtenus qui induisent une réponse anti-LPS.

Entamoeba histolytica : bases moléculaires et cellulaires de la virulence d'un parasite protozoaire (Chercheurs statutaires : Nancy Guillén, Elisabeth Labruyère-Dadaglio Post-doctorant : Paulo Tavares
Doctorant : Sabrina Marion)
L'amibiase invasive repose sur la motilité d'E. histolytica, caractéristique majeure de ce micro-organisme. Nous étudions le réseau intégré de signaux et d’événements moléculaires qui, à partir de la reconnaissance par l’amibe des protéines de surface, aboutissent au mouvement de ce parasite au sein des tissus. Ce mouvement est dû à la dynamique du cytosquelette. Les remaniements du cytosquelette conduisent soit à la polarisation de l'amibe, qui possède alors un uroïde dans la partie postérieure et un pseudopode locomoteur dans la partie antérieure, soit à la formation de pseudopodes phagocytaires. La mise en place de ces appendices permet alors à E. histolytica de se déplacer ou de phagocyter. Plusieurs protéines intervenant dans les remaniements du cytosquelette amibien ont été identifiées. Au niveau de l'uroïde se trouvent la lectine Gal-GalNAc, la Myosine II, RacG et la kinase PAK. Dans le pseudopode locomoteur, la Myosine IB, l'ABP120, la profiline, le complexe Arp2/3 et dans les pseudopodes phagocytaires la Myosine IB. A l’heure actuelle nous essayons de comprendre la synergie de ces molécules dans le processus invasif de E. histolytica. Une approche génétique nous a permis d’inactiver les fonction de la myosine II et de montrer que la perte d’activité myosine conduit à la diminution de la virulence. En effet, lorsque les amibes interagissent avec les cellules épithéliales, elles expriment tout leur pouvoir cytolytique. Nous avons observé un tropisme particulier des amibes pour la bordure en brosse des cellules intestinales. Après contact avec les cellules, les amibes induisent un réarrangement rapide du cytosquelette d’actine suivi par la destruction de la bordure en brosse et par la mort de la cellule. Alors que les amibes sauvages détruisent la monocouche cellulaire en trois heures, la souche amibienne déficiente en myosine II est non toxique et peu de changements sont observés au niveau du cytosquelette cellulaire. Ces résultats indiquent un rôle déterminant pour la myosine II dans le processus pathogène de E. histolytica et des ligands protéiques amibiens intervenant dans la reconnaissance de cellules sont en cours d’identification.

Recherche appliquée en vaccinologie
(Philippe Sansonetti)
Cette année a été marquée par la continuation d'essais de phase I et II de notre souche candidate vaccinale contre la shigellose : S. flexneri 2a - SC602. Ce travail est réalisé en collaboration avec l'US Army, grâce à nos collègues du Walter Reed Army Institute of Research. Les résultats sont très encourageants en terme de tolérance, d'immunogénicité et de protection puisque les volontaires vaccinés sont protégés contre un "challenge" par la souche sauvage. Les essais se poursuivent maintenant au Bangladesh chez l'adulte et l'enfant, un essai de phase III y étant en préparation, et bientôt au Viêt-Nam. Une souche équivalente de Shigella dysenteriae 1 va être aussi testée.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

JACQUEMIN Colette

Chercheurs de l'unité

GUILLEN Nancy, CNRS
LABRUYÈRE-DADAGLIO Elisabeth, IP
PARSOT Claude, IP
PHALIPON Armelle, IP
SANSONETTI Philippe, IP
TRAN VAN NHIEU Guy, INSERM

Stagiaires de l'unité

BLOCKER Ariel, Post-doc
MARION Sabrina, étudiante
MAVRIS Maria, Post-doc
NIEBUHR Kirsten, Post-doc
PAGE Anne-Laure, Thèse
PHILPOTT Dana, Post-doc
RATHMAN Michelle, Post-doc
SICARD-BOURDET Raphaëlle, Thèse
TAVARES Paulo, Post-doc
TOURNEBIZE Régis, Post-doc

Autre personnel de l'unité

d'HAUTEVILLE Hélène, IP
MOUNIER Joëlle, IP
THUIZAT Audrey, IP

Publications de l'unité

En cas de problèmes ou de remarques concernant ce serveur Web, écrire à rescom@pasteur.fr. Cette page a été modifiée pour la dernière fois le Mardi 2 Mai 2000 à 14 h 33 (Temps Universel) .