Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physiologie microbienne pour l'année 1999

CNRS URA 1129


Responsable : TANDEAU de MARSAC Nicole (e-mail : ntmarsac@pasteur.fr )

Résumé du rapport

Apparues il y a 3-3,5 milliards d'années, les cyanobactéries représentent un groupe bactérien majeur tant par leur diversité morphologique et physiologique que par le rôle qu'elles ont joué en créant une atmosphère aérobie sur notre planète et jouent, encore de nos jours, dans l'équilibre des proportions entre le gaz carbonique et l'oxygène. En effet, ces organismes procaryotes partagent avec les plantes la capacité d'effectuer la photosynthèse en utilisant la lumière et l'eau pour la réduction du gaz carbonique, processus qui s'accompagne d'un dégagement d'oxygène. Possédant un très grand potentiel d'adaptation à des environnements, même extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres. Les travaux de recherche réalisés dans l'Unité sont organisés autour de deux axes principaux : 1. La PCC (Pasteur Culture Collection), centre de recherche et de documentation sur les cyanobactéries ; 2. Les mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement.

Abstract

Having appeared 3-3.5 billion years ago, the cyanobacteria constitute a major bacterial group by the diversity of their morphological and physiological properties and by the role they played in the creation of an aerobic atmosphere and still play, nowadays, in the CO2 and O2 balance on our planet. These prokaryotic micro-organisms share with plants the capacity to perform oxygenic photosynthesis by using light and water for the reduction of CO2. Endowed with capacities of acclimation to a wide range of environmental conditions, including extreme ones, they colonize most aquatic and terrestrial ecosystems. Research work in the Unité de Physiologie Microbienne is focussed on two main aspects: 1. The PCC ("Pasteur Culture Collection"), centre of research and documentation on cyanobacteria; 2. The molecular mechanisms controlling the acclimation of cyanobacteria to their environment.

Texte du rapport

  1. La PCC, centre de recherche et de documentation sur les cyanobactéries

La PCC ou Pasteur Culture Collection (R. Rippka). Avec plus de 700 souches pures, dont des cyanobactéries marines atypiques qui synthétisent de la chlorophylle b comme les plantes, la PCC est la plus importante collection dans le monde. Ce centre a des activités de conseil et d'identification ; il assure également l'entretien et la distribution des souches qui sont mises à la disposition des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier. De nouvelles souches ont été isolées d’une source chaude de la station thermale de Saint Thomas-les-Bains (Pyrénées Orientales), puis purifiées (collaboration avec J.M. Navarro, Montpellier). Le tapis microbien dont elles proviennent est utilisé pour la pélothérapie en raison de ses propriétés thérapeutiques cicatrisante et régénératrice des tissus. Ces souches ont été identifiées comme appartenant aux genres Synechococcus, Gloeocapsa, Leptolyngbya, Pseudanabaena et Nostoc. Des collaborations ont été établies avec O. Bouvet (Unité des Entérobactéries, P.A. Grimont, IP), M. Hernandez-Mariné (Universidad de Barcelona, Espagne) et S. Hein (Universität Münster, A. Steinbüchel, Allemagne) pour la caractérisation des inclusions de type polyalkanoïque chez les cyanobactéries. Une autre collaboration établie avec T. Friedl, responsable de la collection de Cultures d’Algues SAG (Göttingen, Allemagne), porte sur la caractérisation des introns des ARNt et l’échange de souches de cyanobactéries entre la SAG et la PCC.

Biodiversité et potentialités biotechnologiques de la PCC (projet BASIC "Biodiversity: applied and systematic investigations of cyanobacteria", programme européen "Biotechnology", 1996-1999) (M. Herdman et R. Rippka). Les objectifs du réseau européen BASIC qui comprenait treize équipes étaient de : i) réviser la taxonomie des cyanobactéries, en combinant des approches physiologique, biochimique et de biologie moléculaire ; ii) identifier des composés bioactifs et/ou d'intérêt biotechnologique et étudier leur distribution chez les cyanobactéries ; iii) identifier les espèces en culture pure ou dans leur milieu naturel. Au cours de ce projet, notre Unité a : i) fourni des souches axéniques et de la biomasse à chaque équipe du consortium ; ii) constitué une documentation photographique portant sur la morphologie des souches ; iii) déterminé les propriétés physiologiques et génétiques, ainsi que les relations phylogénétiques de nombreuses cyanobactéries en utilisant les séquences des gènes codant les ARNr 16S et/ou la taille des régions ITS ("Intergenic transcribed sequence") entre les gènes des ARNr 16S et 23S, couplées à des analyses des profils RFLP ("Restriction fragment length polymorphism"). Les ITS permettent en effet de distinguer des souches dont les séquences des ARNr 16S sont très proches, voire identiques ; iv) adapté aux cyanobactéries et développé la technique d’hybridation in situ basée sur l’utilisation d’oligonucléotides complémentaires de régions spécifiques des ARNr 16S avec marquage à la péroxydase et amplification à l’aide de la tyramide (collaboration avec R.I. Amann, Allemagne). Le projet BASIC a permis également de : i) mettre en évidence des composés protecteurs contre les irradiations UV-B et UV-A et étudier les conditions d’induction de leur synthèse (collaboration avec F. Garcia-Pichel, Allemagne ; ii) identifier les toxines présentes (ou leur absence) dans 200 souches (collaboration avec G. Codd, Royaume Uni) ; iii) montrer que de nombreuses souches sur les 120 testées contiennent des gènes codant des peptides synthétases, et étudier la corrélation entre la présence de ces protéines et la toxicité des souches (collaboration avec T. Börner, Allemagne) ; iv) mettre en évidence la présence de cyanopeptolines et d’autres peptides biologiquement actifs dans 124 souches de la PCC (collaboration avec J. Weckesser, Allemagne).

Bases de données des cyanobactéries de la PCC (M. Herdman et I. Iteman). 1. La base de données des propriétés des cyanobactéries de la PCC (logiciel Microsoft Access sous Windows 98) est en évolution constante. Cette base de données est également accessible sur le Web, via le serveur de l'Institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/). 2. La base de données des ARNr 16S, représentative de la biodiversité des cyanobactéries, contient maintenant plus de 400 séquences alignées. 3. Une autre base de données, qui permet d’identifier rapidement les souches, contient à ce jour 25 séquences ITS alignées et 300 entrées concernant leurs tailles.

Les cyanobactéries dégradent-elles les polychlorobiphényles ? (Contrat R & D entre Schneider-Electric, l’EDF et l’Institut Pasteur, 1997-1999) (N. Tandeau de Marsac). Les polychlorobiphényles (PCB) sont des molécules aromatiques à différents niveaux de chloration, très stables d'un point de vue chimique et thermique. Utilisées dans la construction des transformateurs électriques durant près de 20 ans, ils ont progressivement pollués l'environnement. Ce projet R & D visait à déterminer les capacités de biodégradation des cyanobactéries de la PCC. Le protocole expérimental a été optimisé pour les cyanobactéries et validé en utilisant des souches bactériennes de référence. De nombreuses souches de la PCC ont été testées, mais aucune ne dégrade les PCB de manière significative. D’autres bactéries aérobies ont été isolées de sites pollués par les PCB dont une au moins contient des gènes similaires aux gènes bph impliqués dans le métabolisme du biphényle et des PCB. Les gènes bph de la bactérie Bulkholderia cepacia JHR22 ont été transférés dans la cyanobactérie Synechocystis PCC 6803, ce qui confère à cette dernière une résistance accrue au biphényle.

2. Mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement

Les phytochromes des cyanobactéries, une famille de photorécepteurs ancêtres des phytochromes des plantes (N. Tandeau de Marsac). Certaines cyanobactéries filamenteuses du genre Calothrix différencient des hétérocystes (cellules spécialisées dans la fixation de l’azote moléculaire) et des hormogonies (minifilaments mobiles), et régulent leur composition en pigments (phycocyanine et phycoérythrine) en fonction de la qualité spectrale de la lumière qu’elles reçoivent. D’après des études phylogénétiques, les phytochromes des cyanobactéries sont les ancêtres des phytochromes des plantes, photorécepteurs impliqués dans de multiples processus biologiques chez ces eucaryotes photosynthétiques, tels que la germination, la floraison, la pigmentation etc. Le génome de Calothrix PCC 7601 contient deux groupes de gènes, cphA et rcpA, et cphB et rcpB ; l'opéron cphA-rcpA code le phytochrome CphA, une histidine kinase régulée par la lumière, et le régulateur de réponse RcpA, qui sont similaires aux couples transmetteur/receveur des systèmes à deux composants bactériens ; les gènes cphB et rcpB sont deux unités monocistroniques qui codent des protéines similaires à CphAet RcpB, respectivement. In vitro, un chromophore de type biline se fixe de manière covalente sur CphA et en modifie les propriétés spectrales de façon différente selon la qualité spectrale de la lumière (rouge clair/rouge sombre) ; il en est de même pour CphB, bien que, chez cette protéine, le résidu cystéinyl, site d’attachement du chromophore chez CphA, soit remplacé par un résidu leucyl. Dans le cas de CphB, il s’agit d’une liaison non covalente entre la protéine et le chromophore. Les protéines CphA et CphB interviennent dans une étape précoce de la transmission du signal lumineux rouge clair/rouge sombre par un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation des protéines RcpA et RcpB, respectivement. Les couples CphA-RcpA et CphB-RcpB sont spécifiques, puisque le transfert de phosphate ne peut se faire ni de CphA à RcpB, ni de CphB à RcpA (collaborations avec W. Gärtner, T. Hübschmann et T. Börner, Allemagne). Des mutants dont les gènes cphA et cphB ont été inactivés sont en cours d’analyse (collaboration avec J. Cobley, USA). Des anticorps monoclonaux spécifiques de CphA et de CphB ont été produits en collaboration avec F. Nato (Unité d’Ingénierie des anticorps, J.C. Mazié, IP).

PII, un transmetteur de signal qui coordonne les métabolismes de l'azote et du carbone (N. Tandeau de Marsac). La protéine PII (GlnB) de la cyanobactérie Synechococcus PCC 7942 diffère de celle d’Escherichia coli par son type de modification post-traductionnelle (phosphorylation et non uridylylation), par les conditions qui conduisent à sa modification (le 2-oxoglutarate jouant un rôle majeur dans ce processus, alors que la glutamine n’a pas d’effet), et par les mécanismes que cette protéine contrôle. Chez Synechococcus, PII est sous sa forme non phosphorylée en présence d'ammoniaque et bloque l'entrée des ions nitrate/nitrite, fonction nouvelle pour cette protéine dans le monde bactérien. En l'absence d'ammoniaque, la protéine est phosphorylée mais un autre effecteur est également requis pour rétablir l'entrée de ces ions. Cet effecteur est vraisemblablement le 2-oxoglutarate car il a été montré que ce métabolite se lie à PII in vitro (collaboration avec E. Flores et A. Herrero, Espagne, et avec K. Forchhammer, Allemagne). L'expression du gène glnB et la phosphorylation de son produit sont en partie contrôlées par NtcA, effecteur transcriptionnel pléiotrope impliqué dans la régulation de l'assimilation de l'azote chez les cyanobactéries. PII intervient également dans le contrôle du transport des substrats carbonés (CO2 et/ou HCO3-) chez Synechocystis PCC 6803. Le niveau de phosphorylation de la protéine PII chez Synechococcus et Synechocystis dépend du potentiel redox intracellulaire (collaboration avec S. Bédu et R. Jeanjean, LCB, Marseille).

Prochlorococcus marinus, une cyanobactérie marine atypique (Projet européen PROMOLEC "Prochlorococcus molecular ecology", programme MAAST III, 1998-2001) (N. Tandeau de Marsac et R. Rippka). Cette cyanobactérie marine, de très petite taille (diamètre 0.5-0.6 mm), a le plus petit génome (2 Mb) et le plus faible pourcentage G+C (32%). Ses antennes photosynthétiques sont constituées de complexes protéiques contenant des divinyl-chlorophylles a et b. Elle prolifère en abondance jusqu'à 200 m de profondeur dans les océans oligotrophiques, tropicaux et subtropicaux. De nombreux essais ont été faits pour tenter d'obtenir la croissance de cette souche sur milieu solide, ils devront être continués. Certains aspects du métabolisme de l'azote sont à l'étude. Cette souche croît en présence d'ammoniaque ou d'urée grâce à une activité uréase qui est constitutive. L'uréase a été purifiée à homogénéité. Cette uréase est la plus petite connue à l’heure actuelle ([UreA-UreB-UreC]2 ; 168 kDa) (collaboration avec T. Jahns, Allemagne). Les gènes codant les trois sous-unités de l’uréase et ses quatre protéines accessoires ont été caractérisés. Ils sont organisés sur le chromosome en deux opérons divergents, ureDABC et ureEFG. Chez Prochlorococcus marinus, la protéine PII est de type cyanobactérien. Cette protéine demeure non modifiée quelles que soient les conditions testées, bien que ses structures primaire et quaternaire soient très conservées par rapport à celles d’E. coli et de Synechococcus (collaborations avec S. Loiseaux-De Goër, Station Biologique de Roscoff et A. Blondel, Unité de Biochimie Cellulaire, IP). Il est possible que cette absence de modification soit à mettre en relation avec l’incapacité de cette souche à croître en utilisant le nitrate comme source d’azote (voir paragraphe sur PII ci-dessus).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LEFEBVRE Jacqueline, IP

Chercheurs de l'unité

HERDMAN Michael, CNRS
RIPPKA-HERDMAN Rosmarie, IP

Stagiaires de l'unité

CHOUARI Rakia, Thèse
HUART Virginie Stagiaire
ITEMAN Isabelle, Post-doc
LALOUI Wassila, Post-doc
MHIRI Corinne, Post-doc
PALINSKA Katarzina, Post-doc
ROMARI Khadidja, Thèse
SCHÖNHUBER Wilhelm, Post-doc

Autre personnel de l'unité

CASTETS Anne-Marie, CNRS
COURSIN Thérèse, IP
LAURENT Thierry, IP

Publications de l'unité

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