Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physiologie cellulaire pour l'année 1999

CNRS URA 2172


Responsable : SCHWARTZ Maxime (maxime@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'unité s'intéresse à la physiologie, au métabolisme, et à la génétique de microorganismes de l'environnement. Un groupe s'intéresse aux interactions entre bactéries fixatrices d'azote et plantes. Un deuxième, tout en terminant des travaux sur la cellulolyse bactérienne, entame l'étude de la biodégradation microbienne de produits pétroliers. Un troisième s'intéresse à la germination des spores chez les champignons filamenteux, ainsi qu'à l'établissement de cribles génétiques pour identifier des cibles pour des drogues antifongiques. L'unité inclut un laboratoire des Fermentations, qui fournit des cultures microbiennes à des laboratoires de l'Institut Pasteur ou externes, et qui poursuit des activités de R&D en liaison avec l'industrie.

Abstract

This unit is interested in the physiology, the metabolism, and the genetics of soil microorganisms. One group studies the interactions between nitrogen fixing bacteria and plants. A second group, while it completes its work on bacterial cellulolysis, is starting a study of the microbial degradation of oil products. A third is interested in the mechanisms of spore germination in filamentous fungi, as well as in the development of novel screens for the identification of new antifungal targets. The Fermentation laboratory provides microbial cultures to laboratories inside as well as outside of the IP, and is involved in R&D programs with industrial partners.

Texte du rapport

Fixation biologique de l’azote/Interactions bactéries-plantes (C. Elmerich)

La fixation biologique de l’azote est la réduction de l’azote atmosphérique en ammoniaque par un complexe enzymatique, appelé nitrogénase. Cette propriété est limitée aux seuls procaryotes et elle est largement répandue dans tous les grands phylum bactériens. Ces bactéries présentent une grande diversité dans leur métabolisme, leur mode de vie et dans leur association avec les végétaux. Les travaux réalisés en 1999 ont porté sur deux espèces bactériennes fixatrices d’azote associées avec les céréales, Azospirillum brasilense et une souche de Pseudomonas stutzeri. Ces travaux ont pour objet l’étude de fonctions cellulaires qui permettent à ces bactéries de s’adapter et de fixer l’azote dans leur environnement particulier ainsi que l’identification de gènes bactériens nécessaires dans l’interaction avec la plante hôte.

Azospirillum, comme beaucoup d'autres bactéries du sol, produit de l'acide indole acétique (AIA). Cette hormone végétale joue un rôle dans le développement des racines de la plante hôte, et de ce fait favorise l’adsorption de l’eau et des minéraux, ce qui contribue à un meilleur développement de la plante. Il existe différentes voies de synthèse de l’AIA chez les bactéries. Azospirillum possède la voie de l’indole pyruvate, faisant intervenir une indole pyruvate décarboxylase (IPC). L’isolement et l’étude des propriétés d’un mutant du gène de structure de l’IPC, ainsi que la construction de mutants portant également des mutations dans différents gènes de la voie de biosynthèse du tryptophane ont permis de montrer l’existence d’une autre voie de synthèse de l’AIA qui dépend du tryptophane. Afin d’identifier cette voie, on a recherché des activités enzymatiques pouvant convertir l’indole acétonitrile et la tryptamine en AIA. Les travaux futurs auront pour objectifs l’étude de cette autre voie de synthèse de l’AIA et la construction de souches mutantes incapables de synthétiser cette auxine, afin d’étudier les conséquences de ces mutations sur la colonisation et le développement des racines.

La souche de Pseudomonas stutzeri A1501 a été isolée à partir d’une rizière en Chine dans les années 80. Cette souche fixe l’azote en microaérobiose, elle colonise la surface des racines du riz ainsi que les tissus internes et peut être considérée comme un endophyte du riz. On a entrepris une étude des gènes de la fixation de l’azote et construit plusieurs mutants de phénotype Nif- par interruption des gènes nif. D’autre part on a commencé a caractériser la région contenant le gène rpoN. Un mutant rpoN ne fixe pas l’azote, il est affecté dans l’utilisation de certaines sources d’azote et de carbone et dans ses propriétés de mobilité ainsi que dans sa capacité à coloniser le riz. Directement en aval de rpoN, on a trouvé les gènes ptsN et ptsO qui sont aussi généralement associés à rpoN chez d’autres espèces bactériennes. Les gènes ptsO et ptsN codent pour des protéines ressemblant à l’enzyme IIA et à la protéine Hpr du système PTS, qui intervient dans le transport et la phosphorylation des sucres. Les mutants de ptsN et ptsO sont de phénotype Nif+ et l’activité nitrogénasique du mutant ptsO, ainsi que l’expression d’une fusion nifH-lacZ sont augmentées par rapport à la souche sauvage. Ceci suggère que ptsN et ptsO jouent un rôle modulateur dans l’expression des gènes contrôlés par rpoN.

Chez Pseudomonas aeruginosa, les gènes fleS et fleR sont sous contrôle de rpoN. Ils codent pour un système à deux composants qui gouverne la synthèse des flagelles et joue un rôle dans la pathogénicité. Les gènes fleS et fleR de P. stutzeri ont été clonés. Les travaux futurs porteront sur la construction de mutants fleS, fleR, et sur le rôle de fleS, fleR, rpoN et des gènes associés dans l’infection systémique du riz par la bactérie.

Génétique Fongique (C. d'Enfert)

Germination des spores chez Aspergillus nidulans

Les champignons filamenteux du genre Aspergillus sont connus tant pour leurs applications biotechnologiques que pour les pathologies dont ils sont responsables. La germination des spores (conidies) représente une étape clef dans le cycle de développement du champignon et constitue la première étape dans la colonisation d'un nouvel environnement. Les recherches effectuées visent la caractérisation des événements moléculaires et biochimiques intervenant au cours des phases précoces de la germination et en particulier la compréhension du signal déclenchant le processus germinatif et sa transduction au niveau cellulaire.

Un des événements majeurs de la germination est la dégradation rapide du disaccharide de réserve des conidies, le tréhalose, et l'apparition concomitante d'un pool de glycérol qui pourrait être responsable d'une élévation de la pression osmotique interne lors de la germination. La caractérisation des enzymes impliqués dans la dégradation du tréhalose et l'établissement des mutants correspondant chez l'espèce modèle A. nidulans suggèrent la participation d'un signal AMPc dans l'activation de la germination. Différents gènes intervenant dans la voie de signalisation AMPc ont été caractérisés et inactivés à l’aide d’une stratégie originale de remplacement de gènes facilitant l’identification des souches mutantes obtenues par génétique reverse. Nos résultats démontrent l’implication de la signalisation AMPc dans le contrôle de la germination. Toutefois, il apparaît que cette voie de signalisation n’est pas seule impliquée. La recherche des composants de la voie de transduction du signal agissant en amont ou en parallèle de la synthèse d’AMPc et assurant la réponse de la spore aux conditions environnementales est en cours.

Par ailleurs, plusieurs gènes de A. nidulans codant pour les enzymes de biosynthèse du tréhalose ou du glycérol ont été clonés, et des souches mutantes ont été construites et analysées dans le cadre d'un programme européen BIOTECH, dont l'un des objectifs majeurs est d'évaluer comment des altérations du métabolisme du tréhalose ou du glycérol pourraient être mises à profit pour limiter la croissance des champignons ou améliorer les flux métaboliques. L’analyse des souches mutantes a mis en évidence un rôle du tréhalose dans la résistance du champignon à une exposition prolongée à différents stress. Par ailleurs, l’étude d’une souche dépourvue de glycérol 3-phosphate déshydrogénase a montré d’une part l’existence d’une autre voie de biosynthèse du glycérol chez A. nidulans n’impliquant pas le glycérol 3-phosphate, et d’autre part un rôle inattendu du glycérol 3-phosphate dans la biogenèse de la paroi chez ce champignon.

Mutagenèse insertionnelle chez le champignon pathogène de l’homme Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus est actuellement le principal champignon filamenteux pathogène de l’homme, responsable d’infections systémiques fatales (aspergillose invasive) chez le patient immuno-déprimé, infections pour lesquelles on ne dispose pas de traitement à la fois efficace et sans danger. Les approches de génétique réverse ciblées sur différentes protéines dont on pouvait postuler une implication dans le processus infectieux ne s’étant pas révélées fructueuses, il semble nécessaire de développer de nouvelles stratégies plus exhaustives permettant l’identification de gènes essentiels à la croissance du champignon soit in vitro soit uniquement lors de la colonisation de l’hôte. C’est dans cette optique que nous avons mis au point un système de mutagenèse par transposition en utilisant l’élément transposable impala du champignon filamenteux Fusarium oxysporum. Nos résultats montrent la capacité d’impala à transposer et à se réinsérer de façon aléatoire dans le génome de A. fumigatus. Ces événements de transposition peuvent être associés à des altérations phénotypiques ce qui montre l’intérêt de cet élément transposable en tant qu’outil de mutagenèse chez A. fumigatus.

Analyse transcriptionnelle chez la levure pathogène de l’homme, Candida albicans

Le Groupe de Génétique Fongique fait partie d’un réseau de 7 équipes qui concentrent leurs efforts sur l’étude de la levure dimorphique Candida albicans. Ce champignon commensal est néanmoins responsable des infections fongiques les plus fréquentes chez l'homme à l’heure actuelle. Ces infections affectent généralement les muqueuses, et peuvent évoluer en infections systémiques fatales chez les immunodéprimés. Bien que des traitements faisant appel à des dérivés tri-azolés soient disponibles, leur efficacité reste limitée et l’apparition de souches résistantes rend nécessaire l’élaboration de molécules antifongiques originales.

Dans ce cadre, le Groupe Génétique Fongique est impliqué dans l'établissement de " puces à ADN " porteuses de produits de PCR correspondant à un nombre élevé de gènes de C. albicans et utilisables pour une étude du transcriptome. En effet, la possibilité d’étudier simultanément l’activité transcriptionnelle d’un nombre important de gènes – si ce n’est l’ensemble des gènes – d’un organisme peut contribuer à la fois à une meilleure compréhension de la fonction de ces gènes et des mécanismes mis en jeu dans différentes situations physiologiques, en particulier l’interaction hôte-pathogène.

L’analyse informatique réalisée sur environ 50% des données de séquence disponibles publiquement (http://www-sequence.stanford.edu/group/candida/index.html) a permis d’identifier environ 3000 ORFs potentielles. L’établissement de filtres à haute densité pour 2000 ORFs est en cours d’achèvement. Les membranes seront utilisées dans le cadre du Réseau Infections Fongiques pour étudier l'expression des gènes à une échelle génomique dans des conditions pertinentes vis-à-vis de l’interaction hôte-pathogène.

Dégradation de la cellulose et des produits pétroliers (P. Béguin)

Cellulolyse

La bactérie cellulolytique Clostridium thermocellum produit un complexe multienzymatique exocellulaire, appelé cellulosome, qui comporte de nombreuses cellulases associées à une protéine de charpente appelée CipA. Cette protéine est un polypeptide glycosylé qui présente une structure multimodulaire. Outre un domaine de fixation à la cellulose, qui permet l'ancrage du complexe au substrat, CipA comporte en effet neuf domaines de structures très voisines appelés domaines cohésine. Ces domaines servent de sites de fixation pour les cellulases et les hémicellulases du cellulosome, qui s'y attachent par l'intermédiaire d'un domaine très conservé d'un enzyme à l'autre, appelé domaine dockerine. Les domaines dockerine sont constitués de deux segments très semblables de 24 résidus reliés par un peptide de jonction variable, d'environ 10-15 résidus. Ce principe d'organisation quaternaire est particulièrement souple et permet d'intégrer dans le complexe à peu près n'importe quel enzyme pourvu qu'il comporte un domaine dockerine.

En collaboration avec l'Unité de Biochimie Structurale, nous avons entrepris de caractériser l'interaction cohésine-dockerine sur laquelle repose toute l'organisation du cellulosome. La structure tridimensionnelle du domaine cohésine est connue, et celle du domaine dockerine est en passe d'être publiée par le groupe de David Wu à Rochester. Cependant, les tentatives de cocristalliser les deux domaines afin d'identifier comment ils se lient l'un à l'autre n'ont pas encore abouti. Nos avons donc construit et analysé un certain nombre de mutants ponctuels de deux domaines cohésine et dockerine afin d'en apprendre davantage sur leur mode d'interaction. Les résultats montrent que le domaine dockerine présente vraisemblablement une structure partiellement symétrique, compatible avec la réitération des deux segments qui le composent, de sorte qu'il présente deux sites alternatifs de liaison au domaine cohésine. L'analyse thermodynamique par microcalorimétrie suggère cependant que les deux sites n'ont pas la même affinité. Quant au domaine cohésine, une série d'altérations mutationnelles réparties à la surface de celui-ci a permis de cerner grossièrement la région participant à l'interaction avec le domaine dockerine. De fait, même les mutations ponctuelles affectant la zone présomptive d'interaction n'affectent que peu la stabilité du complexe. Un effet plus marqué est obtenu en combinant plusieurs mutations. Ceci suggère que même si l'interaction globale est forte, elle résulte de la somme de nombreuses liaisons faibles. En conséquence, la destruction d'une seule d'entre elles n'a que peu d'effet. Ce travail achève l'étude de la dégradation de la cellulose par C. thermocellum, qui avait été démarrée il y a une vingtaine d'années dans l'Unité.

Dégradation des produits pétroliers

Nous avons démarré cette année un nouveau projet qui s'inscrit dans le thème général du traitement microbiologique des pollutions de l'environnement. Il s'agit d'étudier des bactéries capables de dégrader certains composants de l'essence qui posent problème lorsqu'ils aboutissent dans l'environnement, en raison de leur forte solubilité dans l'eau ou de leur faible biodégrabilité. Nous collaborons actuellement avec l'Institut Français du Pétrole, qui a isolé des souches de Gordona terrae et Rhodococcus equi dégradant l'éthyl-tert-butyl éther (ETBE) et le méthyl-tert-butyl éther (MTBE). Ces composés sont actuellement ajoutés en grandes quantités à l'essence comme antidétonants. Leur solubilité dans l'eau est relativement élevée, de sorte qu'ils gagnent assez facilement les nappes phréatiques lors de pollutions par l'essence. La caractérisation des étapes enzymatiques du processus de dégradation et le clonage des gènes codant les enzymes impliqués est en cours chez G. terrae. Nous disposons également chez cette bactérie de mutants négatifs spontanés. Comme la souche peut être transformée par des vecteurs navettes mis au point chez d'autres Mycobactéries, des expériences de complémentation génétique pourront être réalisées avec les gènes clonés. Un travail similaire est également en cours avec une souche de Mycobacterium austroafricanum, également isolée à l'Institut Français du Pétrole, et qui est capable d'utiliser les isoalcanes. Ces hydrocarbures, en particulier le 2,2,4-triméthylpentane ou isooctane connu pour ses propriétés antidétonantes, sont d'habitude assez mal dégradés par la microflore naturelle. Un des buts à plus long terme est de développer des sondes d'acides nucléiques dérivées de la séquence des gènes clonés afin de suivre l'évolution des populations bactériennes qui les portent dans l'environnement ou dans des microcosmes reconstitués. Ces sondes fourniraient donc un outil fort utile pour évaluer les capacités de récupération biologique des sites pollués et de mieux gérer ceux-ci.

Activités de service et de recherche appliquée (R. Longin)

Le Laboratoire des Fermentations (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/fermentations/) a poursuivi ses activités de service qui consistent notamment à fournir des cultures microbiennes à des laboratoires de l'Institut Pasteur ou externes. Pour l'année 1999, le laboratoire a réalisé 92 cultures en fermenteurs de 2, 15 ou 300 litres, pour 14 unités de l'Institut Pasteur et 10 laboratoires extérieurs, publics ou privés. 48 cultures de souches recombinantes d’Escherichia coli (classe 1, groupe I, confinement L1) ont été conduites dans différents milieux, à faible, moyenne ou haute concentration cellulaire ou en milieu minimum contenant des éléments marqués. Les conditions utilisées ont permis d’obtenir une très bonne production des protéines. Les autres cultures ont porté sur Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Microcystis aeruginosa, Pseudomonas oleovorens, Saccharomyces cerevisiae. Le laboratoire est aussi spécialisé dans la culture de souches exigeant des conditions particulières (milieux minimaux, anaérobiose stricte, thermophilie, fixation de l'azote, bactéries luminescentes...). Le laboratoire prend en charge certains traitements de la biomasse produite comme le cassage ou certaines étapes de purification. Il est engagé dans une démarche Assurance Qualité.

Des contrats de R &D conclus avec des sociétés de Biotechnologie sont en cours. Ils portent sur l’optimisation des milieux et conditions de culture pour la production de cellules, de spores ou de protéines recombinantes.

Dans le cadre d’activités de recherche et développement, nous avons mis au point et breveté un module original et performant de mesure en continu de la turbidité. Ce module permet d’effectuer des mesures en ligne allant de 0,05 à plus de 300 unités de densité optique, pour des souches d’Escherichia coli ou de Saccharomyces cerevisiae. Ce système est aujourd’hui associé à des batteries de micro-fermenteurs (Multi-Micro-Fermenteurs ‘’MMF’’ de 10 à 60 ml), que nous avons développés. Un capteur de lumière et de fluorescence a également été mis au point pour l’étude de l’expression de gènes rapporteurs comme lux ou GFP. De nouveaux développements sont en cours pour la mesure et la régulation des principaux paramètres de croissance (pH, pO2...). Cet appareillage est automatisé et informatisé. Il permet de cultiver divers types de cellules eucaryotes ou procaryotes, en cultures discontinues ou continues (chemostat, turbidostat, cultures cycliques...). Il a été ainsi été possible de sélectionner différentes souches d’Escherichia coli, de Clostridium thermocellum ou de Saccharomyces cerevisiae présentant des propriétés nouvelles (croissance sur de nouveaux substrats ou à des températures non permissives, résistance à des produits toxiques, augmentation des taux de croissance, obtention de souches floculantes...).

Le concept MMF apporte de nouvelles possibilités de recherche fondamentale ou appliquée : études physiologiques, amélioration des milieux de culture, optimisation des paramètres de fermentation, métabolisme en milieu minimum, criblage à haut débit de substances d'intérêt pharmaceutique, évolution et sélection de souches, le tout associé à un équipement automatisé, miniaturisé et évolutif.

Dans le cadre d'une collaboration entre notre laboratoire et le laboratoire de Génétique Moléculaire des Microorganismes de l'INSA de Lyon (Philippe Lejeune), se poursuivent des études sur la formation de biofilms par Escherichia coli K12, avec différentes souches sauvages ou mutées dans des gènes impliqués dans l’adhérence aux surfaces.

MOTS CLES
interactions bactéries-plantes
cellulolyse
biodégradation des produits pétroliers
génétique fongique
fermentations

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

FERRAND Monique, IP

Chercheurs de l'unité

BEGUIN Pierre, IP
CHAUVAUX Sylvie, IP
D'ENFERT Christophe, IP
ELMERICH Claudine, IP
SCHWARTZ Maxime, IP/CNRS

Stagiaires de l'unité

CARRENO LOPEZ Ricardo, Thèse
CHAO Marie-Laure, stage DESS
DENISET Lucie, stage Ingénieur
De VRIES Ronald, Post-doctoral
FILLINGER Sabine, Post-doctoral
FIRON Arnaud, Thèse
GAILLON Laurent, CDD
GUO Xianwu, Post-doctoral
KULA Christelle, Thèse
TREZZANI Isabelle, Thèse

Autre personnel de l'unité

Ingénieurs :
BELLALOU Jacques, IP
GUGLIELMI Gérard, CNRS
LONGIN Robert, IP
MEIER Alain, IP

Techniciens :
CHAVEROCHE Marie-Kim, IP
DESNOUES Nicole, IP
FRACHON Emmanuel, IP
MIRAS Isabelle, IP

Laboratoire de préparation (commun aux unités de Physiologie Cellulaire, des Membranes Bactériennes et de Biochimie Microbienne) GUICHARD Fernande, IP
IDJA Andrée, IP
LEBON Gisèle, IP
MORVAN Marie-Michelle, IP
MALBERT Marie-Jeanne, IP

Publications de l'unité

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