Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Pharmacologie cellulaire pour l'année 1999

INSERM U 485


Responsable : B. Boris VARGAFTIG (Vargafti@pasteur.fr)

Résumé du rapport

En poursuivant l'Žtude du r™le de l'Žosinophile dans l'allergie respiratoire, nous avons montrŽ la prŽsence de prŽcurseurs d'Žosinophiles dans les voies aŽriennes des souris hyper IgE immunisŽes, leur dŽplŽtion supprimant l'expression de cette allergie. Par ailleurs, pour mieux comprendre les mŽcanismes d'activation du mastocyte, cellule cible essentielle dans l'allergie, nous avons gŽnŽrŽ des anticorps monoclonaux qui reconnaissent des effecteurs molŽculaires impliquŽs dans cette activation et sommes en train d'identifier ces derniers par clonage d'expression. L'administration d'endotoxine bactŽrienne ˆ la souris induit une hyperrŽactivitŽ bronchopulmonaire dont le mŽcanisme diffre de celui qui prŽvaut dans l'allergie, accompagnŽe dÕune intense migration de neutrophiles, dont le r™le est ˆ l'Žtude. Dans le cadre de la modŽlisation du Syndrome de DŽtresse Respiratoire Aigu‘ (SDRA), nous avons montrŽ que le recrutement des neutrophiles dans les voies aŽriennes est en partie responsable de l'augmentation de la permŽabilitŽ vasculaire. In vitro, les neutrophiles sont ainsi capables d'interagir avec les cellules environnantes, en particulier avec les monocytes. Cette migration des neutrophiles rŽsulterait, entre autre, de l'absence de formation d'IL-10 protectrice par les macrophages alvŽolaires activŽs. Chez le cobaye, ces macrophages produisent une phospholipase A2 sŽcrŽtŽe (sPLA2) suite ˆ une stimulation par le LPS. LibŽrŽe dans l'espace alvŽolaire, cette PLA2 est impliquŽe dans l'hydrolyse des phosholipides du surfactant pulmonaire qui conduit au collapsus alvŽolaire. La synthse de la sPLA2 est rŽprimŽe par la PGE2 par un rŽtrocontr™le nŽgatif impliquant l'AMPc, alors que son activitŽ est inhibŽe par une protŽine du surfactant, la SP-A. Ces deux mŽcanismes de rŽgulation joueraient un r™le essentiel dans le contr™le de l'hydrolyse des phospholipides du surfactant au cours du SDRA. Par ailleurs, nous avons montrŽ, dans des cellules endothŽliales pulmonaires humaines, que l'expression de la cyclooxygŽnase-2, qui est augmentŽe par des cytokines pro-inflammatoires, est nŽgativement modulŽe par l'AMPc extracellulaire via une ecto-protŽine kinase A. Globalement, les recherches en cours permettent de corrŽler les mŽcanismes de lÕinflammation allergique et non allergique des voies aŽriennes, et conduisent ˆ un modle intŽgrŽ qui est en cours de validation pour lÕenvironnement.

Abstract

In continuation to our investigations on the role of eosinophils in inflammation, we demonstrated the presence of their precursors in the airways of immunized hyper IgE mice, and that their depletion suppresses the expression of this allergy. In addition, to better understand the mechanisms of mast cell activation, an important target in allergy, we generated monoclonal antibodies which recognize molecular effectors implicated in this activation, and we are now identifying the latter by expression cloning. The administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS) to mice also induces bronchopulmonary hyperresponsiveness accompanied by intense neutrophil sequestration into the airways. This may provide a model of Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), in which neutrophil migration to the airways accounts for an increased vascular permeability. Neutrophils interact with other cells, particularly with monocytes. Their migration into the airways would involve, among other factors, the failure of the activated alveolar macrophages to produce the counter-regulator IL-10. In the guinea-pig, these macrophages secrete phospholipase A2 (sPLA2) upon stimulation with LPS. Once released into the alveolar space, sPLA2 hydrolyses the surfactant phosholipids, leading to alveolar collapse. Synthesis of sPLA2 is downregulated by PGE2 via a negative feedback involving cyclic AMP, whereas its activity is inhibited by the surfactant protein SP-A. Both mechanisms of regulation may be essential for the control of the hydrolysis of surfactant phospholipids during ARDS. We also demonstrated that the expression of cyclooxygenase-2 in human endothelial cells, which is augmented by proinflammatory cytokines, is downregulated by extracellular cyclic AMP via an ecto-protein kinase A. Overall, the investigations in progress allow to correlate the mechanisms of allergic and nonallergic airways inflammation and functional disturbances and lead to an integrated model which is being validated for environmental situations.

Texte du rapport

MŽcanismes de l'hyperrŽactivitŽ bronchique allergique et non-allergique (B. Boris Vargaftig)

L'hyperrŽactivitŽ bronchopulmonaire, une capacitŽ accrue des voies aŽriennes ˆ rŽpondre ˆ des stimuli non-spŽcifiques, est un marqueur fonctionnel de certaines affections pulmonaires, allergiques et non-allergiques. Elle se manifeste aprs une seule provocation allergŽnique chez les souris dites BP2, et requiert des stimulations plus intenses/rŽpŽtŽes sur la lignŽe BALB/c. Cette hyperrŽactivitŽ corrle avec une intense Žosinophilie des voies aŽriennes et leur invasion par des lymphocytes T, probablement de phŽnotype Th2. L'hyperrŽactivitŽ est suivie par une intense mŽtaplasie mucosale. Nous avons montrŽ la participation du gne muc5ac dans lÕinduction de cette mŽtaplasie, et son inhibition par un glucocorticostŽro•de. Contrairement ˆ la notion dominante dans la littŽrature, cette mŽtaplasie et la sŽcrŽtion mucosale qui en dŽpend, ne requirent pas la prŽsence des Žosinophiles et rŽsulteraient notamment de la production dÕIL-13 par une espce cellulaire comme lՎpithŽlium ou les basophiles. Nous avons montrŽ, en collaboration initiale avec lÕUnitŽ de GŽnŽtique MycobactŽrienne, que lÕadministration de BCG par voie intra-nasale aux souriceaux BP2 nouveaux nŽs ou jeunes adultes prŽvient les sŽquelles de lÕimmunisation et de la provocation allergŽniques, dont lՎosinophilie des voies aŽriennes et lÕhyperrŽactivitŽ. Un projet concernant les modalitŽs dÕimmunisation anti-allergique par des produits bactŽriens naturels et biosynthŽtiques est en cours et concernera Žgalement la description dŽtaillŽe des interactions immunitaires chez le nouveau nŽ. Toujours dans le cadre des recherches sur lÕallergie bronchopulmonaire, nous avons montrŽ, en collaboration avec des chercheurs de la Fiocruz et de lÕUniversitŽ FŽdŽrale de Rio de Janeiro (BrŽsil) que les poumons des souris BP2 immunisŽes et provoquŽes contient des progŽniteurs Žosinophiliques, sorte de rŽserve secondaire aprs la mo‘lle osseuse. Le r™le de cette rŽserve dans le dŽclenchement et la pŽrennisation de lÕallergie des voies aŽriennes constitue un sujet de grand intŽrt. Finalement, dans le cadre de lՎvolution thŽmatique vers des sujets concernant lÕenvironnement, une recherche en cours avec un groupe de lÕUnitŽ dÕImmuno-Allergie suggre que les poussires seules induisent une hyperrŽactivitŽ bronchopulmonaire chez la souris, sans inflammation apparente. Elle pourrait rŽsulter de lŽsions ŽpithŽliales.

Les recherches concernant le mode dÕaction du LPS sur les voies aŽriennes se sont poursuivies, avec la dŽmonstration inŽdite de la rŽsistance de certaines sŽquelles ˆ lÕaction anti-inflammatoire des glucocorticostero•des. Ainsi, mme si les titres accrus de TNF-a prŽsent dans les voies aŽriennes et le recrutement alvŽolaire des neutrophiles par le LPS sont supprimŽs par les glucocorticostŽro•des, lÕintense bronchoconstriction, la sŽquestration pulmonaire des neutrophiles et lÕaugmentation de la permŽabilitŽ des voies aŽriennes qui lÕaccompagne sont partiellement ou totalement rŽfractaires ˆ ces mŽdicaments. Ceci rappelle lÕinefficacitŽ des glucocorticostŽro•des contre le SDRA, perturbation gravissime dÕorigine infectieuse/inflammatoire, o les glucocorticostŽro•des se sont rŽvŽlŽs inefficaces, malgrŽ des raisons thŽoriques de postuler leur emploi. LՎtude de la composante cortico-rŽsistante des effets du LPS est en cours et pourrait aboutir ˆ des nouvelles approches contre le SDRA.

Mots clŽs : allergique, asthme, endotoxine, environnement, Žosinophiles, glucocorticostŽroides, SDRA.

Interaction des neutrophiles avec les cellules de l'environnement vasculaire et aŽrien (Michel Chignard et Dominique Pidard)

Les neutrophiles sont des participants actifs dans diverses pathologies pulmonaires inflammatoires (emphysme, bronchite chronique, syndrome de dŽtresse respiratoire aigu‘,...) ou infectieuses (mucoviscidose, aspergillose invasive...). Leurs effets s'exercent en particulier au travers de la libŽration de trois sŽrine protŽinases: la cathepsine G, l'Žlastase et la protŽinase 3. Si elles sont connues depuis longtemps pour leurs activitŽs protŽolytiques sur des protŽines de la matrice extracellulaire, des effets cellulaires sont de plus en plus dŽcrits et pourraient leur confŽrer un r™le nouveau dans les processus inflammatoires.

Nous nous sommes attachŽs ˆ analyser plus particulirement lÕactivitŽ de ces protŽinases sur diverses catŽgories de rŽcepteurs membranaires intervenant dans lÕactivation ou dans les propriŽtŽs dÕadhŽrence de cellules impliquŽes dans le processus inflammatoire. Ainsi, nous avons montrŽ prŽcŽdemment que lՎlastase rŽgule lÕactivitŽ de lÕintŽgrine IIb3 plaquettaire. La cathepsine G et l'Žlastase agissent par ailleurs sur les cellules endothŽliales en inhibant spŽcifiquement leur activation par la thrombine, au travers dÕune protŽolyse du rŽcepteur PAR-1 de cette dernire. Nous venons de montrer que la cathepsine G et l'Žlastase modifient Žgalement la rŽponse des monocytes au LPS, en provoquant une inhibition de la synthse du TNF-_. Suite ˆ leur libŽration par exocytose des neutrophiles activŽs, l'Žlastase et la cathepsine G hydrolysent un rŽcepteur membranaire spŽcifique du LPS, le CD14. La cathepsine G libre un CD14 soluble presque complet, alors que lՎlastase gŽnre une sŽrie de fragments. Des travaux sont actuellement en cours montrant un effet de ces mmes protŽinases sur les neutrophiles eux-mmes. Ainsi, nous avons observŽ quÕelles diminuent l'expression membranaire de CD87/uPAR (urokinase-plasminogen activator receptor), une glycoprotŽine liŽe ˆ la membrane par un groupement glycosylphosphatidylinositol comme le CD14. La protŽolyse de ce rŽcepteur pourrait avoir pour consŽquence une modification de l'adhŽrence et de la capacitŽ de migration des neutrophiles. In vivo, les neutrophiles envahissent les diffŽrents compartiments pulmonaires lors d'une infection locale ou systŽmique. Dans un modle expŽrimental chez la souris, nous avons montrŽ que l'administration de LPS dans les voies aŽriennes supŽrieures induisait la migration des neutrophiles et la libŽration d'Žlastase dans les espaces aŽriens. De faon concomitante, nous avons mis en Žvidence une augmentation biphasique de la permŽabilitŽ alvŽolo-capillaire dont la premire Žtape seule dŽpend de la migration des neutrophiles. Cette migration est contr™lŽe, en partie, par le TNF-_ produit par les macrophages alvŽolaires. De faon inattendue, la synthse de l'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, est, dans le mme contexte, totalement absente. Toutefois, lors d'une infection par Aspergillus fumigatus, l'IL-10 peut, dans certaines conditions, tre dŽtectŽe. La prŽsence d'IL-10 semble rŽsider dans le recrutement, lors d'une inflammation prolongŽe ou rŽpŽtŽe, de monocytes sanguins capables de produire l'IL-10. En fait, aprs plusieurs heures de sŽjour dans le milieu alvŽolaire et leur transformation en macrophages rŽsidents, ces derniers perdraient leur capacitŽ ˆ produire l'IL-10. Nous venons de montrer qu'un composant du surfactant pourrait tre ˆ l'origine de cette rŽpression.

Mots clŽs : dŽfense innŽe/inflammation, ŽpithŽlium, macrophages, neutrophiles, poumon.

R™le de la phospholipase A2 dans lÕinflammation pulmonaire (Lhousseine Touqui)

Nous avons mis au point un modle animal qui reproduit les critres anatomo-pathologiques du syndrome de dŽtresse respiratoire aigu‘ (SDRA) chez l'homme. Ce modle est basŽ sur l'administration d'une endotoxine bactŽrienne, le lipopolysaccharide (LPS), par voie intra-trachŽale chez le cobaye. Le LPS provoque une inflammation pulmonaire aigu‘ accompagnŽe d'une expression accrue de la phospholipase A2 sŽcrŽtŽe (sPLA2) et de sa libŽration dans l'espace alvŽolaire. Les macrophages sont la principale source de cette enzyme dont lÕexpression est induite par un processus autocrine/paracrine mŽdiŽe par le TNF-alpha et inhibŽe par lÕAMPc. Des rŽsultats rŽcents montrent que la synthse de cette enzyme est Žgalement induite dans un modle de SDRA consŽcutif ˆ une administration intra-trachŽale de Pseudomona aeruginiosa chez le rat. LÕaltŽration du surfactant pulmonaire est une caractŽristique du SDRA conduisant ˆ l'apposition permanente des parois alvŽolaires entravant ainsi la diffusion de l'oxygne. Nous avons montrŽ que la sPLA2 est impliquŽe dans cette altŽration aussi bien chez le cobaye traitŽ par le LPS que chez le rat infectŽ par Pseudomona aeruginiosa. Cette altŽration est due, au moins en partie, ˆ l'hydrolyse par la sPLA2 des phospholipides du surfactant qui gŽnrent. Cette hydrolyse est rŽgulŽe par une protŽine du surfactant, la SP-A (surfactant protein A) qui inhibe lÕactivitŽ de la sPLA2 par une interaction spŽcifique et calcium-dŽpendante. Des Žtudes sont en cours pour identifier la (ou les) rŽgions de la SP-A impliquŽes dans cette inhibition. Enfin des rŽsultats rŽcents ont montrŽ que les acides gras insaturŽs libŽrŽs par la sPLA2 ˆ partir des phospholipides du surfactant inhibent lÕexpression de la sPLA2 par les macrophages alvŽolaires. Ceci suggre que la sPLA2 peut tre rŽgulŽe par un processus de rŽtrocontr™le nŽgatif par les produits de son action catalytique. En conclusion lՎtude des mŽcanismes impliquŽs dans lÕinhibition de la synthse et/ou de lÕactivitŽ de la sPLA2 constitue un axe de recherche prometteur pour mettre au point une thŽrapie efficace pour le traitement du SDRA chez lÕhomme.

Mots clŽs: ARDS, macrophages, phospholipase A2, surfactant, TNF.

Etude des voies de signalisation au sein des plaquettes et des cellules endothŽliales pulmonaires humaines (Mohamed Hatmi)

LÕendothŽlium constitue une interface dynamique capable de rŽpondre localement aux divers stimuli du compartiment vasculaire. Les cellules endothŽliales qui tapissent la paroi vasculaire interagissent avec les cellules environnantes, en particulier, les plaquettes. Ces cellules jouent un r™le clŽ dans l'hŽmostase et la thrombose et participent activement ˆ lÕinitiation et ˆ la propagation de la rŽaction inflammatoire. Les voies de signalisation impliquŽes dans leur activation sont complexes et mettent en jeu de nombreuses enzymes dont les cyclooxygŽnases, les protŽines kinases et les mŽtalloprotŽinases. Nous nous sommes dÕabord intŽressŽs au r™le modulateur de lÕAMPc, un nuclŽotide gŽnŽrŽ ˆ partir de lÕATP sous lÕaction de lÕadŽnylyl cyclase. LÕAMPc joue un r™le important dans la rŽgulation de la fonction plaquettaire: son ŽlŽvation intracytosolique active la protŽine kinase (PK)A et sÕoppose ˆ la mobilisation du calcium. Bien que largement documentŽ sur le versant intracellulaire, son r™le extracellulaire est encore inconnu. Nous avons dŽmontrŽ, ˆ la surface des plaquettes humaines au repos, lÕexistence dÕune activitŽ PK dŽpendante de lÕAMPc extracellulaire. Nous avons, ensuite, identifiŽ sa cible plaquettaire majeure comme Žtant le CD36, un rŽcepteur multifonctionnel de nature glycoprotŽique capable de lier le collagne, la thrombospondine et les globules rouges infectŽs par le plasmodium falciparum. Concernant le r™le de lÕAMPc dans la modulation de la fonction endothŽliale, nous avons dŽmontrŽ que les cellules endothŽliales pulmonaires humaines des microvaisseaux expriment aussi ˆ leur surface une PKA. Cette enzyme dont lÕactivitŽ est Žtroitement dŽpendante de lÕAMPc extracellulaire, inhibe lÕinduction de la cyclooxygŽnase de type 2 (Cox-2). Nous avons montrŽ, en effet, que la Cox-2 est fortement induite par le PMA, de manire prŽcoce. Nous avons ensuite montrŽ, par diffŽrentes approches expŽrimentales, que lÕAMPc extracellulaire inhibe lÕinduction de la Cox-2 par le PMA. Nous avons aussi quantifiŽ lÕactivitŽ Cox en Žvaluant la production de la 6-cŽtoPGF1alpha, principal produit de dŽgradation de la prostacycline. La synthse de ce mŽtabolite, accrue sous lÕaction du PMA, est significativement attŽnuŽe par lÕAMPc extracellulaire. Outre la caractŽrisation de ces activitŽs ecto-PKA plaquettaire et endothŽliale et leurs consŽquences fonctionnelles sur ces cellules, nos rŽsultats indiquent que lÕAMPc est non seulement un second messager intracellulaire mais aussi extracellulaire. Enfin, nous nous intŽressons ˆ lՎtude des mŽtalloprotŽinases (MMPs), une famille dÕenzymes impliquŽes dans divers processus physiopathologiques comme le remaniement de la matrice extra-cellulaire, la dissŽmination mŽtastasique ou lÕinflammation. Nous avons ŽtudiŽ lÕexpression de ces enzymes au sein des plaquettes humaines et avons examinŽ leurs effets potentiels sur la rŽactivitŽ plaquettaire. Nous avons, ainsi, montrŽ la prŽsence de la MT1-MMP, une mŽtalloprotŽinase activatrice de la MMP2, ˆ la fois dans le sŽrum et dans le plasma des volontaires sains. Nous avons, ensuite, Žtablit que la MT1-MMP est exprimŽe ˆ la surface plaquettaire sous forme de deux espces molŽculaires de 45 et 89 kDa. Aprs dŽgranulation des plaquettes, seule celle de bas poids molŽculaire persiste. Nous avons montrŽ, par ailleurs, que les plaquettes expriment les ARNm codant pour la MT1-MMP, la MMP2 et le TIMP2. LÕexpression par ces cellules des trois ŽlŽments composant le complexe trimolŽculaire nŽcessaire ˆ lÕactivation de la pro-MMP2 a ŽtŽ mise en Žvidence par cytomŽtrie en flux sur des plaquettes activŽes. En rŽsumŽ, notre thme de recherche a pour objet dÕexplorer les voies de signalisation impliquŽes dans les fonctions plaquettaires et endothŽliales, notamment les r™les des PKA et des enzymes pro-inflammatoires telles que la Cox-2 et les mŽtalloprotŽinases matricielles.

Mots clŽs : AMPc, cellules endothŽliales, cyclooxygŽnases, mŽtalloprotŽinases, plaquettes, protŽine kinase A.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LEFAUCHEUX Corinne, I.P.
VILLENEUVE Josiane, I.P.

Chercheurs de l'unité

BENHAMOU Marc, INSERM
CHIGNARD Michel, INSERM
HATMI Mohamed, IP
PIDARD Dominique, CNRS
TOUQUI Lhousseine, IP
VARGAFTIG B. Boris, IP

Stagiaires de l'unité

AIT SAID Fatima (thse)
ALAOUI AZHER Mounia (thse)
CANDE CŽcile (DEA)
CHABOT Sophie (thse)
ELALAMY Isma•l
FERNVIK Eva (post-doc)
JACQUEMIN Claude (Chercheur EmŽrit)
LAPORTE Pascale (DEA)
PASTORELLI Carole (DEA)
SALEZ Laurent (thse)
SANTOS MAXIMIAMO Elisabeth (thse)
VEIGA Jo‘l (BTS)
WU Yongzheng (post-doc)

Autre personnel de l'unité

BALLOY Viviane, INSERM
BERMAN Bruce, IP
JOSEPH Danielle, CNRS
LEDUC Dominique, IP
LEFORT Jean, IP
MAMAS Suzanne, IP
MEMBRILLERA Antonio, IP
MOTREFF Laurence, IP
NAHORI Marie-Anne, IP
RUFFIE Claude, IP
SAHLI Fatima, IP
SINGER Monique, INSERM
THOURON Franoise, IP

Publications de l'unité

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