Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physicochimie des Macromolécules biologiques pour l'année 1999

CNRS URA 1773


Responsable : BUC Henri (henribuc@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Toutes les polymérases qui recopient des acides nucléiques ou des complexes nucléoprotéiques présentent des éléments communs de structure tertiaire. Nous voulons savoir si, des ARN polymérases aux transcriptases inverses, des modules identiques exercent de fait des fonctions analogues en favorisant une approche cinétique et en développant des traitements thermodynamiques aussi rigoureux que possible.

Abstract

All polymerases which copy nucleic acid templates or nucleoprotein complexes present common tertiary structural motives. Do they use in fact a common strategy involving these related domains ? We develop kinetic approaches, coupled with thermodynamic analyses, to answer these questions.

Texte du rapport

Cinétique structurale (Malcolm Buckle).

L'établissement des contacts séquentiels entre l'ARN polymérase d'Escherichia coli et le promoteur bactérien lacUV5 a été caractérisé à une température qui permet une accumulation notable de complexes intermédiaires. Le rôle majeur de la sous-unité sigma70 de cette enzyme dans ce processus a été établi par des méthodes cinétiques. En parallèle, une technique analytique qui permet de caractériser les peptides de cette sous-unité en contact intime avec les bases de la matrice a été mise au point. Néanmoins la structure de l'ARN polymérase d'E. coli est encore mal résolue. Les recherches ont donc été étendues à l'ARN polymérase du bactériophage T7 pour laquelle une meilleure structure tridimensionnelle a été établie. En appliquant les techniques de photopontage et d'empreintes, la formation progressive d'un complexe cinétiquement compétent sur un promoteur consensus a été caractérisée pour cette deuxième enzyme. Un parallèle convaincant a pu ainsi être établi entre les deux systèmes. Les méthodes mises au point ont pu être utilisées pour la caractérisation quantitative d'autres complexes entre acides nucléiques et protéines.

Contrôle différentiel de l'expression des gènes (Annie Kolb).

Le travail de ce groupe est centré sur l'étude de la reconnaissance de promoteurs sous le contrôle du facteur sigma de phase stationnaire, sigmaS, et sur la comparaison des deux formes d'ARN polymérases d'E. coli associées aux facteurs sigmaS et sigma70. Il s'agit d'un problème fondamental (le contrôle différentiel de l'expression des gènes), et difficile (puisque in vitro les promoteurs sigmaS dépendants ne présentent pas, vis-à-vis des promoteurs sigma70 dépendants de caractères discriminatifs évidents). La comparaison de ces deux holoenzymes par des méthodes biochimiques est poursuivie pour mettre en évidence leurs différences dans les modes de reconnaissance du promoteur et leurs interactions avec les protéines régulatrices (activateurs, répresseurs et facteurs anti-sigma). Deux méthodes nouvelles d’empreintes ont été développées ; elles permettent, après introduction d’un site kinase marqué au P32 à l’extrémité N ou C terminale de la protéine, ou après modification d’une cystéine unique de la protéine par le Fe-BABE, de cartographier les interactions de sigma avec ses nombreux partenaires (protéines ou ADN). La première a été utilisée pour localiser les contacts de sigma70 avec l’anti-sigma du phage T4, la protéine AsiA, la seconde pour préciser le positionnement de sigmaS dans l’holoenzyme libre et sur le promoteur. Il a été ainsi possible de montrer que le facteur sigmaS avait une affinité plus faible et un positionnement légèrement différent vis-à-vis de l'enzyme-cœur que le facteur sigma70, et que le positionnement de ces holoenzymes sur un promoteur ambivalent où elles sont toutes deux capables de dépasser la transcription est aussi partiellement différent. Une région auxiliaire dans la sous-unité sigma70, la région 2.5, devient essentielle dans la sous-unité sigmaS. Par contraste, la région qui reconnaît l'hexamère -35 a un rôle plus crucial chez sigma70. La reconnaissance moins étendue du promoteur par l'enzyme de phase stationnaire paraît être avantageuse pour cette ARN polymérase. Elle lui permettrait d'échapper à l'effet inhibiteur de nombreuses protéines qui recouvrent l'ADN en phase stationnaire.

Protéine H-NS (Sylvie Rimsky).

Une de ces protéines du chromoïde, H-NS, a été aussi intensément étudiée au laboratoire par S. Rimsky et ses collaborateurs. Son mode d'association en solution et sur les séquences d'ADN pour lesquelles H-NS a beaucoup d'affinité a été précisé. En collaboration avec plusieurs groupes de l'Institut Pasteur, son rôle de régulateur a été précisé sur l'opéron flhDC ou sur le gène codant pour la protéine ChiA d'E. coli.

Transcriptases inverses (Marc Lavigne ; Matteo Negroni).

Les études mécanistiques réalisées in vitro sur des processus essentiels de la transcription inverse du génome du VIH-1 (terminaison au CTS et recombinaison homologue) ont été poursuivies. Marc Lavigne a identifié deux paramètres structuraux majeurs de la terminaison au CTS : la présence de blocs d'ADN double brin très stables situés en aval des terminateurs, ainsi que la synthèse de motifs AnTm situés juste en amont des terminateurs. Il a montré que la compression du petit sillon d'ADN interne à ces motifs était responsable de la chute importante de processivité de l'enzyme. La structure de complexes enzyme/ADN formés à un site de terminaison est actuellement analysée à l'aide de différents outils biophysiques.

La mise au point d'un système d'étude in vitro de la recombinaison au cours de la synthèse du brin (-) d'ADN a permis à Matteo Negroni d'identifier des séquences favorisant ce processus. Cette étude a été réalisée avec différentes transcriptases inverses, sur ARN nu ou sur ARN couvert par la protéine de nucléocapside. Deux points ont été clairement mis en évidence : d'une part, l'absence totale de corrélation entre la localisation des points chauds de recombinaison et la présence de pauses durant la biosynthèse de l'ADN sur la matrice initiale (ARN donneur) et, d'autre part, le rôle essentiel joué dans la structuration de l'ARN accepteur par la nucléocapside lors de ce transfert. Sur ces bases, un modèle pour le mécanisme de saut de brin s'opérant sans arrêt de biosynthèse a pu être proposé, modèle actuellement mis à l'épreuve au laboratoire.

Autres travaux (Miria Ricchetti ; Edouard Yeramian).

Les événements de transcription inverse et de transposition ne sont pas l'apanage des seuls rétrovirus. En collaboration avec l'Unité de Génétique Moléculaire des Levures, il a été possible à Miria Ricchetti de mettre en évidence l'intégration de séquences d'ADN mitochondrial dans le génome de la levure.

Edouard Yeramian a montré la puissance de l'analyse de modes coopératifs de déformation de l'ADN dans l'analyse de la structure des séquences de génomes eucaryotes ou procaryotes. Lorsqu'un traitement rigoureux de thermodynamique statistique est appliqué pour la simulation des désappariements des ADN double-brins correspondants, il est possible de faire une lecture originale des signaux fonctionnels, séquences de régulation, opérons, introns et exons par exemple.

MOTS-CLÉS
ARN polymérases. Chromoïde bactérien. Cinétique structurale. Thermodynamique statistique. Transcriptases inverses.

LIEN : http://www.cnrs.fr/

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DELPECH Odile, CNRS
TEL : (0)1 4568 8704
Télécopie : (0)1 4061 3060

Chercheurs de l'unité

BUCKLE Malcolm, CNRS
KOLB Annie, IP
LAVIGNE Marc, IP
ORSINI Gilbert, Université Paris 7
RICCHETTI Miria, IP
RIMSKY Sylvie, CNRS
YERAMIAN Édouard, CNRS

Stagiaires de l'unité

BADAUT Cyril, Doctorant
COLLAND Frédéric, Doctorant
MOUMEN Abdeladim, Doctorant
NEGRONI Matteo, Post-doctorant
PEMBERTON Iain, Post-doctorant
PLACE Christophe, Post-doctorant
SCLAVI Bianca, Post-doctorant

Autre personnel de l'unité

KOTLARZ Denise, CNRS
LEGAT Geneviève, IP
MARTIN Béatrice, IP
POLOMACK Bernadette Lucette, IP
ROUX Pascal, IP
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Publications de l'unité

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