Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Neurovirologie et Régénération du Système nerveux pour l'année 1999


Responsable : DUBOIS-DALCQ Monique (mdalcq@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Cette Unité est organisée en 5 groupes de recherches En neurovirologie/neuroimmunologie, nous avons démontré (1) l'infection persistante par le poliovirus dans la moelle spinale de souris dont les neurones infectés meurent par apoptose; in vitro, les mutants persistants montrent des altérations de l’entrée du virus dans la cellule (2) l’existence d’un nouveau récepteur du virus de la rage (N-CAM); l’infection rabique de la souris peut causer l’apoptose des lymphocytes in vitro et, au cours de l’encéphalite virale, des lymphocytes en apoptose sont observés dans le cerveau; de plus l’encéphalite virale cause une perte de la capacité des splénocytes à produire des cytokines TH1; la base immunologique des vaccins antirabiques a été analysée. (3) la signalisation de la chemokine alpha SDF-1 exprimée par les neurones du SNC et les effets biologiques de son attachement au récepteur CXC-R4 sur ces neurones. En neurobiologie, nous étudions
(1) l'origine et le développement des oligodendrocytes qui synthétisent la myéline dans le système nerveux central ainsi que leur régénération au cours des maladies démyélinisantes. En particulier, nous analysons les signaux qui induisent la genèse des oligodendrocytes à partir des cellules souches neurales multipotentielles . Notre intérêt s’étend a l’étude de la pathogenése de l’adrenoleukodystrophie. (2) les connexines, une famille multigénique de protéines qui forment ls canaux intercellulaires responsables de la communication directe entre cellules. En particulier, on s’attache à définir les mécanismes cellulaires et moléculaires des maladies associées aux mutations des connexines. Les connexines exprimées dans la rétine sont aussi caractérisées sur le plan moléculaire et fonctionnel.

Abstract

In the field of neurovirology/ neuroimmunology, we study how Poliovirus (PV) establishes persistent infections in vitro and in vivo. Mutant viruses are able to persistently infect non-neural cells and show alterations in entry of the virus into cells. In a mouse model, we have shown that poliovirus persists in the CNS following the onset of paralytic poliomyelitis. We study the molecular and cellular mechanisms of persistent infection and how poliovirus induces apoptosis in CNS motoneurons of paralytic mice. We has shown that the neural cell adhesion molecule NCAM expressed at the neuro-muscular junctions and on the membrane of neurons is a receptor for rabies virus. We demonstrated that lymphocytes are target cell for the non neurotropic rabies virus strain used to vaccinate wild life orally and that rabies virus infection triggers apoptosis. The role of Fas, caspases and the proto-oncogene Bcl-2 in signaling and controlling rabies virus induced apoptosis has been investigated. We analyzed the immunological basis of efficacy of this type of live vaccines and demonstrated that apoptotic bodies containing rabies virus antigens are strong immunogens. We also analyzed the inflammation of the nervous system caused by rabies virus infection by measuring the cytokines, chemokines produced in the nervous system and by determining the nature of migrating cells in the course of rabies infection. We assayed their role in the control of the infection by using mouse deficient for cytokines, receptors of cytokines, Fas ligand and certain subsets of lymphocytes. Finally, we have shown that the alpha chemokine SDF-1 triggers the migration of neuronal progenitors through CXC-R4 signalling and MAP kinase activation and that SDF-1 is expressed in selective groups of neurons an dis developmentally regulated during cerebellar hippocampus formation.

In the field of neuroscience, we study the development and regeneration of oligodendrocytes, the myelin-forming cells of the CNS. To analyse the molecular signals that trigger multipotential neural stem cells to become oligodendrocytes, we use in vitro systems that mimicks proliferation, migration and differentiation of neural precursors from the periventricular zone. We have shown that neuregulin signaling regulates neural precursor growth and the generation of oligodendrocytes in vitro. In a X-linked genetic disease of myelin, adrenoleukodytrophy, we have demonstrated apoptosis of oligodendrocytes. Other research focuses on the molecular and cellular biology of connexins. This multigene family of proteins forms the intercellular channels clustered at gap junctions and allows cells to share ions, small metabolites and second messengers, thus coordinating a wide range of behaviors. One of the goals is to understand the molecular and cellular defects of human genetic diseases associated with connexin mutations. We are also pursuing the functional characterization of the connexin subgroup preferentially expressed in retinal neurons.

Texte du rapport

L'infection Persistante du Poliovirus
(F. Colbère-Garapin)

Le poliovirus (PV) est l'entérovirus humain le mieux caractérisé au niveau de sa structure, de son génome et de son mode de multiplication. Il est donc utilisé comme modèle des entérovirus. Après avoir montré que le PV peut établir une infection persistante dans des cellules humaines d'origine neuronale en culture (F. C.-G. et coll., PNAS 1989, 86, 7590), nous avons développé différents modèles d'infections persistantes dans des cellules nerveuses ou non-nerveuses, et poursuivons l'étude de leurs mécanismes moléculaires.

Au cours de l'infection persistante des cellules humaines de neuroblastome IMR-32 par le PV, des virus mutés (PVpi) sont sélectionnés. Certaines mutations des PVpi affectent des acides aminés de la capside localisés dans des régions impliquées dans les interactions avec le récepteur cellulaire (PVR, ou CD155). Ceci nous a amenés à étudier le PVR exprimé par les cellules au cours de l'infection persistante. Le PVR est une protéine de la superfamille des immunoglobulines, qui comporte trois domaines extracellulaires, une région transmembranaire et une région cytoplasmique; seul le premier domaine extracellulaire interagit directement avec le PV. Dans les cellules IMR-32 infectées de manière persistante nous avons identifié, de manière répétée, des mutations situées exclusivement dans le premier domaine du PVR (N. Pavio et coll., Virol., 2000, 274, 331-342). Ces mutations ont été introduites individuellement dans le gène PVR cloné et les gènes PVR ainsi mutés ont été transfectés dans des cellules PVR-négatives. Nous avons montré que les mutations du PVR confèrent une résistance partielle à la lyse induite par le PV. L’adsorption du virus sur ces récepteurs mutants n’est pas modifiée mais en revanche, il y a une diminution de l’efficacité des changements de conformation de la capside médiés par le récepteur (collaboration avec B. Blondel et T. Couderc). Ceci suggère que la décapsidation induite par les récepteurs mutants est peu efficace. Le mécanisme moléculaire du maintien de cette infection fait donc intervenir une co-évolution virus-cellules et une modification des interactions virus-récepteur.

Les PVpi sélectionnés dans les cellules neuronales humaines sont, contrairement à leurs souches parentales, capables d'établir des infections persistantes dans des cellules non-nerveuses. Nous avons identifié les déterminants viraux impliqués dans ce phénotype. Un seul déterminant est parfois suffisant pour conférer à un virus lytique la capacité d'établir des infections persistantes dans les cellules non-nerveuses HEp-2, mais l'association de plusieurs mutations a un effet synergique. Certains mutants persistants subissent après l'adsorption sur le récepteur un changement de conformation atypique de la capside, ce qui génère une particule intermédiaire qui pourrait retarder l'entrée du génome viral dans la cellule. Nous approfondissons l'étude des premières étapes de l'infection cellulaire, en utilisant du récepteur soluble purifié (collaboration avec A. Nomoto et M. Arita (Tokyo). Il est connu depuis de nombreuses années que les entérovirus peuvent persister chez l’individu immunodéficient, en particulier chez certains individus agammaglobulinémiques, l’infection intestinale pouvant être inapparente pendant plusieurs années avant qu’une maladie chronique se déclare éventuellement. Des études récentes ont montré que les individus immunodéficients vaccinés avec les souches Sabin de PV avant que leur immunodéficience soit connue, peuvent être porteurs du virus et l’excréter pendant plus de dix ans. L’administration de gammaglobulines peut prévenir une poliomyélite chronique sans arrêter l’infection virale persistante. Or, l’éradication de la poliomyélite nécessite l’éradication du PV. Il faut donc résoudre le problème posé par la persistance du virus dans l’intestin des immunodéficients. J. Martin (N.I.B.S.C., Angleterre) a caractérisé des souches de poliovirus ayant persisté deux ans chez une femme hypogammaglobulinémique, restée asymptomatique (J. Martin, et coll. J. Virol. 2000, 74, 3001-3010). Ces souches dérivent de la souche vaccinale de type 3 Sabin 3. Il est intéressant de remarquer que certaines mutations sont identiques, ou très voisines de celles que nous avons mises en évidence dans le génome de PVpi persistant dans les cellules humaines de neuroblastome (G. Duncan et coll., Virol., 1998, 241, 14-29). La persistance du PV n’a jamais été étudiée dans un système in vitro de cellules intestinales humaines. Pour comprendre les mécanismes de persistance du PV dans l’intestin humain, nous développons un modèle en collaboration avec Javier Martin, utilisant les isolats de la patiente hypogammaglobulinémique et des cellules intestinales humaines. Ces travaux nous permettront d’évaluer l’importance relative des déterminants viraux et cellulaires dans l’infection persistante.

Physiopathologie de l'infection persistante du poliovirus dans le système nerveux central murin. (B. Blondel et T.Couderc)

Les virus neurotropes en général, et les virus à ARN non rétroviraux en particulier, peuvent persister dans le système nerveux central (SNC) après la phase aiguë de l'infection et engendrer de nouvelles pathologies plusieurs mois, voire plusieurs années, après l'infection initiale. Les patients ayant développé une poliomyélite paralytique présentent, plusieurs décennies après la phase aiguë de la maladie, une nouvelle pathologie appelée syndrome post-polio et une infection persistante du poliovirus dans le SNC pourrait expliquer cette pathologie. Nous avons testé la capacité du poliovirus à persister dans le SNC murin grâce à des mutants dérivés de la souche PV-1/Mahoney qui présentent la particularité d'induire chez la souris une poliomyélite paralytique qui, comme chez l'homme, n'est pas systématiquement mortelle. La présence du poliovirus a été recherchée dans la moelle épinière de souris jusqu'à 12 mois post-paralysie. A tous les temps étudiés, les antigènes viraux et les particules virales ont été mis en évidence dans le cytoplasme des neurones moteurs de la moelle épinière après immuno-marquage (collaboration avec Josette Destombes et Danielle Thiesson, URA CNRS 2115, Pitié-Salpétrière, Paris). L'ARN viral a également été détecté après réverse transcription et amplification par PCR. Ces résultats montrent que le poliovirus persiste dans le SNC des souris au moins jusqu'à 12 mois post-paralysie. Ce modèle nous permet également d'étudier la cytopathologie de l'infection du SNC par le poliovirus. Nous avons montré qu’au cours de la phase aiguë de la poliomyélite paralytique les lésions sont associées à un processus apoptotique.

Mise en évidence d’un nouveau récepteur pour le virus rabique (M. Lafon)

En faisant l’hypothèse que la susceptibilité à l’infection rabique des lymphocytes, à la surface desquelles le virus se lie, avait pour origine l’expression d‘un récepteur pour le virus, nous avons recherché parmi les molécules de surface connues, quelles étaient celles dont la présence corrélait avec la susceptibilité au virus de la rage. La comparaison de la nature des molécules exprimées à la surface de cellules susceptibles ou non susceptibles à l’infection par le virus, nous a permis de proposer que NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) puisse être ce récepteur.

La caractérisation du rôle de NCAM comme récepteur pour le virus de la rage a été établie sur la base des expériences suivantes : 1. l’incubation de cellules permissives avec du virus de la rage diminue l’expression de NCAM à leur surface (cytofluorimétrie et microscopie) mais pas celle d’autres protéines de surface comme CD49f (chaîne alpha de l’intégrine 6). Cette régulation, proportionnelle à la dose du virus, est spécifique du virus de la rage puisque qu’elle n’est pas obtenue par un traitement avec du virus de la vaccine. 2. l’infection est bloquée à la fois par le sulfate d’héparine, le ligand naturel de NCAM, et aussi par des anticorps spécifiques de NCAM 3. l’incubation du virus de la rage avec du NCAM soluble, mais pas avec la laminine, une molécule de la matrice extra-cellulaire, neutralise le pouvoir infectieux du virus. Le traitement avec NCAM est sans effet sur le pouvoir infectieux du virus de la vaccine. La courbe d’effet dose de neutralisation, de nature sigmoïde, s’accorde avec l’organisation à la surface du virion des glycoprotéines rabiques cible du récepteur sous forme de polymères. 4. la transfection de cellules résistantes, par une des isoformes de NCAM est suffisante pour restaurer jusqu’à 50% de leur susceptibilité. 5. les cultures de neurones primaires de souriceaux invalidés pour le gène NCAM (KO) ne sont pas permissives à l’infection rabique à la différence des cultures de neurones primaires issus de souriceaux de type parental 6. les souris adultes invalidées pour le gène NCAM présentent, lorsqu’elles sont infectées par le virus de la rage, un délai de survie en comparaison des souris de type parental.

L‘ensemble de ces résultats constitue un faisceau d’évidences qui permet de proposer que NCAM exprimée aussi bien à la surface des lymphocytes activés (elle porte alors le nom de CD56) qu’à la surface des neurones ou au niveau des jonctions neuro-musculaires puisse être un nouveau récepteur pour le virus de la rage

Le virus de la rage aurait ainsi deux récepteurs : le récepteur nicotinique à l’acetylcholine, l’AChR, et NCAM. Il reste à établir si ces deux molécules agissent comme des co-récepteurs, ou si, par leur répartition différentielle au niveau du système nerveux, ils ne constituent pas deux voies d’entrée distinctes. Nous envisageons que la différence de pathologie des souches de virus rabique puisse refléter une utilisation différente des deux récepteurs. Nous faisons l’hypothèse que les souches pathogènes seraient capables d’utiliser les deux récepteurs à la différence des mutants de pathogénicité atténuée qui n’en utiliseraient qu’un seul.

Apoptose des lymphocytes infectés par le virus de la rage (M. Lafon)

Après avoir montré que les lymphocytes infectés par les souches de virus de la rage atténuées (utilisées pour la vaccination orale des renards) entraient en apoptose (Thoulouze et al 1997), nous avons cherché à caractériser les signaux responsables de l’entrée en apoptose et les effets que l’apoptose pouvait avoir sur le cycle viral et sur la réponse vaccinale.

Nous avons démontré que le seul contact du virus avec la membrane de la cellule n’était pas suffisant pour induire l’apoptose, mais, par contre, que les phases ultérieures du cycle viral étaient indispensables au processus. En effet, l’apoptose ne commence à être détectée que 18h après l’infection, lorsque la protéine G virale commence à s’accumuler dans le cytoplasme de la cellule, alors que la protéine N s’y accumulait depuis la dixième heure après infection. La concomitance entre l’entrée en apoptose et l’accumulation de la G dans le cytoplasme pourrait indiquer que l’accumulation de protéine G soit le signal initiateur de l’apoptose.

L’apoptose rabique fait intervenir des caspases, aussi bien de type ICE que caspase plus tardive comme caspase 3, comme le montre la capacité des peptides inhibiteurs de caspases DVED, YVAD et ZVAD, à réduire l’apoptose induite par le virus de la rage. L’apoptose induite par le virus de la rage est combattue par la sur-expression de Bcl-2 comme le montre l’absence d’apoptose dans les cellules Jurkat transfectées par le gène Bcl-2 (don de Nicole Israël, Unité de Biologie des Rétrovirus, Institut Pasteur) bien que celles-ci soient aussi susceptibles à l’infection rabique que les cellules non transfectées.

L’apoptose rabique ne perturbe pas la production du virus de la rage par les lymphocytes dans la première semaine de la culture (phase aiguë de l’infection). L’apoptose a pour conséquence de libérer une grande quantité de protéine N (Lafon et al, 1998). Cette protéine qui est un superantigène (Lafon et al, 1992, 1994) est dotée de propriétés adjuvantes dont nous avons démontré l’effet à l’égard d’une vaccination hétérologue (Astoul et al, 1996) mais qui est aussi effective comme adjuvant dans la vaccination antirabique (Dietzschold et al, 1987, Montano-Hirose et Lafon, 1995). Nous pensons donc que le mécanisme de l’infection des lymphocytes suivie de leur apoptose puisse être, non pas un phénomène immunosuppresseur, ni même neutre comme il est souvent proposé, mais, être au contraire, un phénomène qui permet l’amplification de la réponse immune. Ce processus pourrait participer à la très grande efficacité des vaccins rabiques atténués utilisés pour la vaccination orale des renards (voir paragraphe suivant).

Si la majeure partie de la population de lymphocytes infectés par le virus de la rage meure par apoptose au cours de la première semaine, une fraction survit et une infection persistante s’établit. L’établissement de la persistance s’accompagne d’une surexpression de la protéine Bcl-2 et d’une répartition d’antigènes viraux particulière. Cette repartition d’antigènes viraux est la même que celle observée dans les Jurkat transfectées avec Bcl-2, suggérant que Bcl-2 perturbe le trafic intracellulaire des antigènes viraux (protéines G et N).

Bases immunologiques de l’efficacité des vaccins antirabiques atténués (du type de ceux distribués sous forme d’appât pour vacciner les réservoirs de la faune sauvage) (M. Lafon)

Les vaccins antirabiques oraux utilisés en Europe ont permis, en vaccinant les réservoirs sauvages, qui en Europe sont essentiellement constitués de renards, d’éradiquer la rage d’Europe occidentale. Ces vaccins, distribués sous forme d’appât, sont constitués de particules virales vivantes dont la pathogénicité est atténuée. La grande efficacité de ces vaccins pourrait simplement résulter de leur capacité à amplifier leur charge antigénique par réplication dans les macrophages et les lymphocytes. Toutefois, nous avons établi in vitro que l’infection des lymphocytes induit leur mort par apoptose. Il est donc difficile d’admettre qu’un vaccin qui induit la mort des lymphocytes qu’il infecte puisse être dans le même temps fortement immunogène. Nos résultats permettent de proposer que le pouvoir protecteur des vaccins antirabiques vivants résulte de la conjonction de 5 propriétés : 1) le virus n’infecte qu’une fraction des lymphocytes 2) l’apoptose est un phénomène qui intervient trop tardivement dans le cycle viral pour diminuer la propagation et l’amplification de la charge virale 3) l’apopotse libère des antigènes viraux comme la protéine N et la nucléocapside dont les propriétés d’adjuvant de vaccination liées à leur propriété de superantigènes sont bien documentées 4) les corps apoptotiques absorbés par les cellules dendritiques sont une source importante d’antigènes efficacement présentés au système immunitaire 5) les lymphocytes infectés produisent des cytokines comme l’INF-gamma. C’est de l’ensemble de ces propriétés que les vaccins antirabiques de la famille ERA et ses dérivés pourraient tirer leur extrême efficacité (Lafon et al, 1999, sous presse)

Perturbations immunologiques du système nerveux infecté par le virus de la rage. (M. Lafon).

Nous avons poursuivi la description des réponses immunes locales (système nerveux) de l’infection rabique dans deux modèles d’infection rabique (encéphalomyélite non fatale avec séquelles paralytiques et encéphalite aiguë fatale). Cette année, nous avons ainsi étudié les cinétiques d’apparition des cytokines (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) et des chimiokines (IP-10, MIP-2,MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, TCALPHA-3) dans le cerveau de souris développant soit une encéphalite, soit une rage paralytique. L’utilisation de lignées de souris de susceptibilité différente à l’infection rabique, et de souris déficientes en certaines cytokines, nous a permis de définir le rôle de l’inflammation et la nature des cytokines dans la survie ou l’aggravation des symptômes de la maladie. Nous avons aussi étudié la nature des cellules immunes (T, B, CD4, CD8, macrophages) présentes dans le cerveau au cours de ces deux types d’infection soit par cytofluorimétrie soit par immunohistochimie sur coupes de moelles épinières et de cerveaux infectés. Sachant que le système nerveux est un territoire immunologiquement privilégié qui dispose d’un système Fas-Fas ligand permettant théoriquement l’élimination par apoptose des lymphocytes potentiellement dangereux pour la pérennité des fonctions nerveuses, nous avons recherché la présence d’apoptose dans le système nerveux des souris immunocompétentes au cours de l’infection rabique. Nos résultats indiquent clairement que les broyats de cerveaux ou de moelles épinières des animaux infectés par le virus de la rage contiennent des noyaux cellulaires qui subissent le processus d’apoptose et que la majorité des cellules entrant en apoptose sont des lymphocytes CD3+.

Immunosuppression et encéphalite virale (M. Lafon)

Certaines infections virales du système nerveux sont capables, par l’immuno-suppression qu’elles induisent, d’accroître la susceptibilité de l’organisme à des infections secondaires d’origine virale, bactérienne ou parasitaire. En utilisant un modèle d’encéphalite virale, celui de l’infection du système nerveux de la souris par la souche CVS du virus de la rage, nous avons cherché à préciser la nature de l‘immuno-suppression périphérique induite. Pour cela, nous avons cherché au cours de l’infection 1) à déterminer par phenotypage des tissus lymphoïdes périphériques à l’aide d’anticorps dirigés contre les marqueurs CD4/CD8, CD69, CD2, CD11, NK, quelle était la nature des populations lymphocytaire touchées et 2) à évaluer la capacité ex vivo des splenocytes à produire des cytokines (IL-2, IL-4, IFN-gamma et TNF-alpha) par la technique de détection des cytokines intra-cellulaires. La capacité de l’organisme souffrant d’une encéphalite virale à se défendre contre une infection secondaire a été mimée en comparant les réponses ex vivo des splenocytes de souris infectées et non-infectées, au contact d’un mitogène (ConA) ou à celle de lipo-saccharides bactériens (LPS). Pour cela, la production des cytokines intra-cellulaires et leur sécrétion après 48 et 72h de culture (IL-4, 5, 6, 10, 12, TNF-alpha et INF-gamma) ont été mesurées dans des cultures de splenocytes stimulées soit par de la ConA soit par du LPS. Nos résultats indiquent qu’en plus de la perte de cellularité des organes lymphoïdes, l’encéphalite rabique induit un état d’immuno-suppression qui se caractérise par une perte de la capacité des splenocytes à produire des cytokines, surtout celles de type TH1, et oblitère sévèrement la réponse à la ConA alors que la réponse au LPS est préservée. Ces résultats suggèrent que l’impact sur le système immunitaire d’une infection virale du système nerveux est sélectif.

Développement et régénération de la myéline (M. Dubois-Dalcq et al)

La myéline permet la conduction rapide des influx nerveux le long des faisceaux axonaux et est essentielle à la plupart des fonctions motrices, sensorielles et intégratrices du système nerveux. Cette membrane multilamellaire est synthétisée par les oligodendrocytes dans le système nerveux central. La myéline est attaquée au cours des maladies démyélinisantes d'origine génétique, virale ou autoimmune. Nous étudions comment les oligodendrocytes sont engendrés à partir des cellules souches du système nerveux central chez les rongeurs et l’homme. Pour ce faire, nous propageons les cellules souches neurales multipotentielles du cerveau qui peuvent engendrer des astrocytes, neurones et oligodendrocytes. Nous investiguons la nature des signaux qui induisent le destin oligodendrocytaire dans ces cellules et leur migration. Ces processus sont importants aussi pour la régénération de la myéline chez l’adulte comme le montre des expériences de transplantation de précurseurs capables de réparer la myéline lésée. Nous étudions aussi la physiopathologie d’une maladie génétique de la myéline, l’adrenoleukodsytrophie. Un autre sujet- dérivé de notre intérêt dans lesinteractions du vIH avec le les cellules du systeme nerveux central est l’étude du rôle d’une chemokine alpha, SDF-1 et sa signalisation au cours du développement du système nerveux central. Les résumés de ces travaux depuis 1999 sont présentés ici en anglais.

I. Myelin-forming cells in development and disease

  1. Remyelination properties of glial restricted precursors Keirstead H.S et al J Neuroscience, 19, 7529-7536, 1999; coll with Cambridge, England.

We have investigated whether glial-restricted precursors can repair a demyelinating lesion in adult rats (, England). To do this, immunoselected PSA-NCAM+ neural precursors expanded with FGF-2 and transplanted in a chemically-induced focal demyelinating lesion which has been irradiated to inhibit remyelination by endogenous cells. We showed that these neural precursors can completely remyelinate such CNS lesions, generating oligodendrocytes, astrocytes and Schwann cells in vivo when confronted with demyelinated axons in a glia-free area. We confirmed the transplant origin of these Schwann cells using Y-chromosome in situ hybridisation and immunostaining for the peripheral myelin protein P zero of tissue from female rats that had been grafted with male CNS cells. Schwann cells are neural crest derivatives and rare neural crest precursors might be present in the precursors growing in vitro. Yet PSA-NCAM+ neural precursors did not generate Schwann cells in vitro even in the presence of Glial Growth Factor, a factor essential to Schwann cell growth. The distribution of numerous Schwann cells within remyelinated tissue, and the absence of P0 mRNAs in donor cells, indicated that Schwann cells were generated by expansion and differentiation of transplanted PSA-NCAM+ neural precursors. Thus, transplantation into demyelinated CNS tissue reveals an unexpected differentiation potential of a neural precursor, resulting in remyelination of CNS axons by PNS and CNS myelin-forming cells.

B. Signals promoting oligodendrocyte development from neural precursors.

(1) Sonic hedgehog. Murray, Rottkamp et al, in preparation The potential to generate OP from neural stem cells (NSCs) exists throughout the developing CNS. Yet, they emerge only in restricted regions of the developing spinal cord in response to the a morphogen Sonic hedgehog (Shh). As the territory of Shh expression extends to the ventral telencephalic region in rodents, we have investigated whether it can trigger oligodendrocyte emergence in the developing forebrain. Shh and its receptor Patched were detected by RT/PCR in subventricular zone (SVZ) tissues of newborn rats at the time of intense gliogenesis. In contrast Shh was not detected in E17 cortex where no oligodendrocytes had developed yet. We then tested the ability of recombinant Shh to induce OP in E17 cortical explants. After 3 days, OP emerged one day earlier in the presence of Shh than in controls. Two days later, we observed an Shh dose dependant increase in the percentage of OP with a maximum of a ten fold increase at 10 µg/ml. Using cocultures of cortical precursors with quail cells expressing Shh (courtesy of Dr Duprez), we observed a doubling of the mitotic index in oligodendrocyte progenitors and up to a 9 fold increase in cells expressing oligodendrocyte specific glycolipids. These data suggest that, as in the embryonic spinal cord, Shh can signal cortical precursors to become oligodendrocytes.

(2) Neuregulins (NRG) (Calaora, Rogister et al, submitted ) coll with Liege university Neuregulin 1 (Nrg-1) isoforms have been shown to influence the emergence and growth of oligodendrocytes, the CNS myelin-forming cells. We have investigated how Nrg-1 signaling of ErbB receptors specifically controls the early stages of oligodendrocyte generation from multipotential neural precursors (NP). We show here that embryonic striatal NP express multiple Nrg-1 transcripts and proteins, as well as their specific receptors, ErbB2 and ErbB4, but not ErbB3. The major isoform synthesized by striatal NP is a transmembrane Type III isoform called Cystein-rich domain Nrg-1. To examine the biological effect of Nrg-1, we added soluble ErbB3 (sErbB3) to growing neurospheres. This inhibitor of Nrg-1 bioactivity decreased NP mitosis and increased their apoptosis, resulting in a significant reduction in neurosphere size and number. When NP were induced to migrate and differentiate by adhesion of neurospheres to the substratum, the level of type III isoforms detected by RT/PCR and Western blot decreased in parallel with a reduction in Nrg-1 fluorescence intensity in differentiating astrocytes, neurons and oligodendrocytes. Pretreatment of growing neurospheres with sErbB3 induced a three fold increase in the proportion of oligodendrocytes generated from NP migrating out of the neurosphere. This effect was not observed with an unrelated soluble receptor. Addition of sErbB3 during NP growth and differentiation enhanced oligodendrocyte maturation as shown by expression of galactocerebroside and myelin basic protein. We propose that both Type III Nrg-1 signaling and soluble ErbB receptors modulate oligodendrocyte development from NP.

C. Development of an Efficient Gene Transfer method in Mouse Neural Precursors with a Bicistronic Retroviral Vector. Franceschini et al, in press , coll Lyon ENS

Gene transfer into neural precursors is a powerful approach to study the function of specific gene products during nervous system development. Here, we describe a retrovirus-based methodology to transduce foreign genes into mouse neural precursors. We used a high titer bicistronic retroviral vector which encodes a marker gene, placental alkaline phosphatase (plap) and a selection gene, neomycin phosphotransferase II (neoR), under the translational control of two retroviral internal ribosome entry segments. Transduction efficiency even without selection was up to 95 % for multipotential neurospheres derived from embryonic striata and grown with basic fibroblast growth factor 2. Expression of plap and neoR was sustained with time in culture and upon differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, as shown by double immunofluorescence labeling with cell type-specific markers, Western blotting and neomycin resistance. However, levels of plap were decreased in differentiated oligodendrocytes. Transduction with the same vector of neonatal oligodendrocyte precursors grown in oligospheres consistently resulted in a lower proportion of plap-immunoreactive cells and enhanced cell death in the absence of neomycin. Yet, plap expression was maintained in some differentiated oligodendrocytes expressing galactocerebroside or myelin basic protein. Since neurospheres can be easily expanded in vitro and since factors enabling their differentiation into the three main central nervous system cell types are being elucidated, this methodology could be used in the future to produce large number of transduced differentiated neural cells.

D. Molecular Pathogenesis of a genetic disease affecting CNS myelin: X-linked adrenoleukodystrophy.(coll with INSERM, St Vincent de Paul/Necker,). Aubourg and Dubois-Dalcq, Glia, 29, 186-190, 2000 ; Feigenbaum et al., Neurobiology of Disease, 7, 600-612, 2000.

Mutations in the ALD gene coding for an ABC transporter in the peroxisomal membrane of glial cells can lead to a demyelinating disease with a rapid fatal outcome in boys. ALD mutations tend to cluster in this transporter functional regions without correlating with a particular clinical course. Is the increase in very long chain fatty acids in blood and brain the disease trigger? The ALD protein is expressed in astrocytes, microglia and oligodendrocytes but not in neurons. How does it cause myelin, once formed, to degenerate and bring inflammation into this genetic disease? Would apoptosis of myelin-forming cells be a primary event? To investigate whether apoptotic processes take place in the ALD brain, we examined autopsy specimens from telencephalic and brainstem regions of four patients and compared these tissues to those of three controls. Two ALD patients showed internucleosomal DNA fragmentation, suggesting a high number of apoptotic cells in affected white matter regions. By this method, none of the controls showed apoptosis in either brain white matter or brainstem. In three ALD patients, in situ detection of DNA breaks by the TUNEL method revealed stained nuclei with chromatin alterations in areas of demyelination. Identification of the cells with TUNEL positive nuclei showed that up to 47% of apoptotic nuclei pertained to oligodendrocytes. Caspase-3 immunostaining was also detected, indicating that programmed cell death was taking place in these cells. We conclude that apoptosis of oligodendrocytes may account, at least in part, for the demyelinating process in the ALD brain.

II. Alpha chemokine signalling in the CNS: the HIV-coreceptor CXC-R4 and the alpha Chemokine Stromal Cell-derived factor 1 ; SDF-1 Expression in the rodent brain Lazarini et al European J Neuroscience, 12, 1-9, 2000; To Nam Tham et al, in press

CXCR4 is the Gi protein-linked seven-transmembrane receptor for the alpha chemokine Stromal Cell-Derived Factor 1 (SDF-1). SDF-1 is an alpha-chemokine that stimulates migration of hematopoietic progenitor cells and development of the immune system. Its receptor, CXC-R4, is highly conserved between human and rodent. CXCR4 is also a coreceptor for entry of human immunodeficiency virus (HIV) in T cells and is expressed in the CNS. To investigate how these CXCR4 ligands influence CNS development and/or function, we have examined the expression and signalling of this chemokine receptor in rat neurons and astrocytes in vitro. CXCR4 is expressed in both cell types and in E15 brain neuronal progenitors. CXCR4 signalling by SDF-1 of these progenitors induced activation of extracellular signal regulated kinases (ERKs) and a dose-dependent chemotactic response. In differentiated neurons, both SDF-1 and the glycoprotein of HIV, gp120, triggered activation of ERKs and cjun amino-terminal kinase (JNK1). These effects were significantly inhibited by Pertussis toxin, which uncouples Gi proteins, and by the bicyclam AMD3100, a highly selective CXCR4 antagonist. Rat astrocytes also responded to SDF-1 signalling by phosphorylation of JNK1 and ERKs but, in contrast to cortical neurons, no kinase activation was induced by gp120. Thus neurons and astrocytes can respond differently to signalling by SDF-1 and/or gp120. As SDF-1 triggers directed migration of neuronal progenitors, this alpha chemokine may play a role in cortex development. In differentiated neurons, both natural and viral ligands of CXCR4 activate specific kinases and may therefore influence neuronal function. In support of this idea is the developmental Pattern of Expression of SDF-1 in the rat central nervous system. SDF-1 is abundantly and selectively expressed in the developing and mature CNS. At embryonic day 15, SDF-1 transcripts were detected in the germinal periventricular zone and in the deep layer of the forming cerebral cortex. At birth, granule cells in the cerebellum and glial cells of the olfactory bulb outer layer showed an SDF-1 in situ hybridization signal that decreased progressively within the next two weeks. In other regions such as cortex, thalamus and hippocampus, SDF-1 transcripts detected at birth progressively increased in abundance during the postnatal period. SDF-1 protein was identified by immunoblot and/or immunocytochemistry in most brain regions where these transcripts were detected. SDF-1 was selectively localized in some thalamic nuclei and neurons of the fifth cortical layer as well as in pontine and brainstem nuclei which relay the nociceptive response. The presence of SDF-1 transcripts in cerebellar granule cells was correlated with their migration from the external to the inner granular layers with disappearance of the signal when migration was completed. In contrast, SDF1 mRNA signal increased during formation of the hippocampal dentate gyrus and stayed high in this region throughout life. The selective and regulated expression of SDF-1 in these regions suggests a role in precursor migration, neurogenesis and, possibly, synaptogenesis. Thus, this alpha chemokine may be as essential to nervous system function as it is to the immune system.

Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires des maladies associées à des mutations de connexines. (Roberto Bruzzone)

Au cours des dernières années des associations entre connexines mutées et pathologie humaine ont été mises en évidence. La forme liée à l'X de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMTX) est associée à des mutations du gène codant pour la connexine32 (Cx32). Nous supposons que des signaux spécifiques entre l'axone et la région péri-nucléaire de la cellule de Schwann permettent l'expression continue de gènes de la myéline et que la présence de canaux formés par la Cx32 est indispensable à la propagation de ces signaux dans la cellule de Schwann. Nous avons démontré que certaines mutations entraînent une perte totale de la capacité de former des canaux fonctionnels tandis que d'autres sont capable d'induire des courants macroscopiques comme la Cx32 sauvage. Nous envisageons d'exploiter cette différence pour caractériser le défaut moléculaire responsable du CMTX. Plus récemment, il a été démontré que la forme plus la fréquente de surdité non-syndromique est associée à des mutations du gène codant pour la Cx26. Nous allons tester la capacité de différentes mutations humaines à former des canaux intercellulaires. Ces expériences devraient nous permettre d’établir la base physiologique des altérations produites par les mutations découvertes chez les patients atteints de surdité non-syndromique.

Identification de connexines dans le système nerveux central et étude de leur rôle dans le développement des oligodendrocytes à partir de cellules souches. (R. Bruzzone)

Le but de cette recherche est l’identification de connexines au cours de la différenciation des progéniteurs des oligodendrocytes et l’analyse de l’implication de cette voie de communication intercellulaire dans la détermination du phénotype oligodendrocytaire. Notre hypothèse est que le passage de signaux par le biais des connexines est crucial pour coordonner la différenciation de groupes de cellules souches neurales. Cette approche devrait nous permettre de caractériser de nouvelles connexines, dont le rôle sera établi par l'inactivation du gène chez la souris.

Synapses électriques et vision: caractérisation moléculaire et fonctionnelle de connexines exprimées dans la rétine. (Roberto Bruzzone)

La rétine de mammifère est formée d'un ensemble de cellules neuronales diverses dont la plupart sont reliées par les canaux intercellulaires, véritables synapses électriques localisés dans les jonctions gap. Ces canaux participent aux connexions latérales entre les cellules de même type ou de type différent constituant ainsi un réseau dans lequel le signal peut diffuser largement. Nous avons cloné et caractérisé fonctionnellement trois nouvelles connexines exprimées préférentiellement dans la rétine de poisson et avons proposé que ces connexines constituent un nouveau sous-groupe de connexines "non-conventionnelles", la branche g de la famille des connexines. La première connexine g (Cx36) s'exprimant dans des cellule neuronales de la rétine de mamifères a été identifiée. Notre but est de caractériser toutes les connexines rétiniennes chez les mammifères, d'étudier leur expression et adressage cellulaire et d'établir une carte fonctionnelle des canaux intercellulaires qui relient les neurones de la rétine.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BARAN Corinne, IP, e-mail : cbaran@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

BLONDEL Bruno, IP, e-mail : bblondel@pasteur.fr BRUZZONE Roberto, IP, e-mail : bruzzone@pasteur.fr COLBERE-GARAPIN Florence, IP, e-mail : fcolbere@pasteur.fr COUDERC Thérèse, IP, e-mail : tcouderc@pasteur.fr DUVAL Nathalie, IP, e-mail : natoche@pasteur.fr GALELLI Anne, CNRS, e-mail : agalelli@pasteur.fr LAFON Monique, IP, mlafon@pasteur.fr
PREHAUD Christophe, IP, cprehaud@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BALOUL Leïla, Thèse
BAULAC Stéphanie, Thèse
CALAORA Viviane, Post-doctorant
CAMELO Serge, Thèse
CASTELLANOS Jaime, Post-doctorant
FRANCESCHINI Isabelle, Post-doctorant
GOSSELIN Anne-Sophie, Thèse
LABADIE Karine, DEA
LAY Stéphanie, DEA
LAZARINI Françoise, Post-doctorant
MITROPOULOU Giorgia, Thèse
OUZILOU Laurent, Thèse
SIMONIN Yannick, Thèse
ZEMMOUR Sarah, Thèse

Autre personnel de l'unité

BELLANCE Edmond, aide de laboratoire
CASANOVA Philippe, technicien supérieur IP DUMON Agnès, technicienne IP, en contrat à durée déterminée GABELLEC Marie-Madeleine, ingénieur IP
GOMES Danielle, technicienne supérieure IP GUIVEL-BENHASSINE Florence, technicienne supérieure IP LAFAGE Mireille, technicienne supérieure IP MURRAY Kerren, technicienne supérieure IP PELLETIER Isabelle, technicienne supérieure IP THAM To Nam, Ingénieur IP

Publications de l'unité

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