Rapport d'activité de l'unité Neisseria pour l'année 1999

Responsable : ALONSO Jean-Michel (jmalonso@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux de recherche de l'unitŽ, Centre National de RŽfŽrence des MŽningocoques (CNRM), portent sur l'ŽpidŽmiologie et la pathogŽnie molŽculaires des infections ˆ Neisseria meningitidis, le mŽningocoque. Les th�mes principaux sont l'analyse gŽnŽtique des processus d'adhŽsion et d'invasion bactŽriennes et leur rŽgulation ainsi que l'analyse physiopathologique des mŽcanismes de translocation tissulaires ˆ partir des sites primaires d'adhŽsion et de colonisation.

Abstract

Main research topics of the unit, National Reference Center for the Meningococci, are in the field of the molecular epidemiology and pathogenesis of infections due to Neisseria meningitidis, the meningococcus: the characterization of virulence determinants and regulatory genes encoding adhesion and invasion at a structural and functional level.

Texte du rapport

La surveillance des infections ˆ N. meningitidis dans le cadre du CNRM (Jean-Michel Alonso et Muhamed-Kheir Taha).

Neisseria meningitidis est un agent majeur de mŽningites (environ 30% des mŽningites bactŽriennes aigu‘s) et de mŽningococcŽmies (septicŽmies), ainsi que d'arthrites et de pŽricardites et peuvent se compliquer de purpura fulminans et de choc septique mortel. LÕincidence mondiale varie de 1 ˆ 10/100000 selon les contrŽes, avec des taux de mortalitŽ pouvant atteindre 10%. En France, l'incidence reste stable ˆ <1/100000 depuis 11 ans. Les cas restent sporadiques et il nÕy a pas dÕŽpidŽmie. La proportion des diffŽrents sŽrogroupes parmi les 415 souches de N. meningitidis isolŽes dÕinfections systŽmiques en 1999 montre que le sŽrogroupe B reste dominant (69%) suivi par le sŽrogroupe C (22%), le sŽrogroupe W135 (3,85%) et le sŽrogroupe Y (3,6%). LÕexamen du nombre de souches isolŽes dÕinfections systŽmiques dans les diffŽrentes classes dÕ‰ges confirme les donnŽes ŽpidŽmiologiques admises : forte incidence chez lÕenfant dÕ‰ge prŽscolaire, puis immunisation naturelle progressive ; les infections de lÕadulte et du sujet ‰gŽ survenant gŽnŽralement au dŽcours dÕaffections entra”nant un dŽficit immunitaire. Vingt deux cas de mŽningococcies mortelles ont ŽtŽ recensŽs (taux de lŽtalitŽ de 5%) en 1999. Dans 14/22 cas, un mŽningocoque du sŽrogroupe C Žtait incriminŽ, ce qui conforte la rŽputation de virulence ŽlevŽe associŽe ˆ ce sŽrogroupe, malgrŽ lÕabsence dÕidentification de dŽterminants pathogŽniques particuliers.

Les beta-lactamines, et en particulier encore ˆ ce jour la pŽnicilline G, restent le traitement de choix des mŽningococcies. LÕexpŽrience de leur utilisation montre leur grande efficacitŽ lorsquÕelles sont administrŽes d�s les premiers signes cliniques Žvocateurs. Les distributions des valeurs de CMI de la pŽnicilline G, de lÕamoxicilline et du cŽfotaxime parmi les souches de mŽningococcies systŽmiques des sŽrogroupes B, C et W135 et Y montrent qu' en ce qui concerne la pŽnicilline G et lÕampicilline, les CMI sont Žgales ou supŽrieures ˆ 0,125 mg/L pour environ un tiers des souches des quatre sŽrogroupes les plus frŽquents, sans jamais atteindre cependant le seuil critique de 1mg/L, Žquivalent ˆ la concentration dans le LCR lors de traitements aux doses habituellement utilisŽes. Aucune souche de N. meningitidis beta-lactamase (cŽfinase) positive nÕa ŽtŽ caractŽrisŽe. En outre, les donnŽes de lÕantibiogramme montrent que toutes les souches Žtaient sensibles au cŽfotaxime et ˆ la ceftriaxone, au chloramphŽnicol, et ˆ la ciprofloxacine. Elles Žtaient toutes rŽsistantes ˆ la streptomycine, et 99% Žtaient rŽsistantes aux sulfamides.

Travaux de recherche.
Nos recherches sÕappuient sur lÕanalyse des donnŽes du CNRM, gr‰ce ˆ des collaborations avec nos correspondants nationaux et internationaux et ont pour principaux objectifs de contribuer ˆ la dŽfinition des meilleurs algorithmes du diagnostic, ˆ la mise au point de techniques rapides et fiables, et ˆ lÕanalyse des mŽcanismes pathogŽniques molŽculaires et cellulaires de ces infections. ƒpidŽmiologie molŽculaire de N. meningitidis : Identification et typages.(M-K.Taha) LÕisolement du mŽningocoque ˆ partir des prŽl�vements biologiques reste dŽlicat ˆ cause de la fragilitŽ de ces bactŽries et des conditions de transmission au laboratoire. De plus, lÕantibiothŽrapie prŽcoce, de plus en plus prŽconisŽe en cas de suspicion de mŽningococcie, rend encore plus difficile lÕisolement de la bactŽrie. La recherche des antig�nes mŽningococciques solubles est peu sensible et parfois non spŽcifique. Nous avons dŽveloppŽ une approche globale de diagnostic et de caractŽrisation de N. meningitidis basŽe sur lÕamplification de plusieurs g�nes, directement ˆ partir des prŽl�vement biologiques (sang, liquide cŽphalo-rachidien, etc.). Cette mŽthode permet, lÕidentification de N. meningitidis par lÕamplification du g�ne de rŽgulation crgA, puis la prŽdiction du sŽrogroupe de la souche incriminŽe, par lÕamplification du g�ne siaD de la biosynth�se de la capsule (sŽrogroupes B, C, Y/W135) ou lÕamplification de lÕorf2 de la cassette impliquŽe dans la biosynth�se des polyosides capsulaires du sŽrogroupe A.

Typage molŽculaire de N. meningitidis basŽ sur le polymorphisme des g�nes pilA, pilD et crgA (M-K.Taha).

Nous avons exploitŽ le polymorphisme de trois loci chromosomiques pour le typage molŽculaire de N. meningitidis : le g�ne rŽgulateur pilA, g�ne conservŽ dans le genre Neisseria, qui code une protŽine cytoplasmique non soumise ˆ variation antigŽnique ou de phase, le g�ne pilD qui code la peptidase responsable de la maturation de la piline chez le mŽningocoque et le g�ne crgA qui code pour une protŽine rŽgulatrice. La base de cette approche est dÕamplifier les g�nes pilA, pilD et crgA par une rŽaction de PCR. Le polymorphisme de ces loci est ensuite ŽtudiŽ ˆ lÕaide de diffŽrentes enzymes de restriction. Ainsi, un certains nombre dÕall�les des g�nes pilA,pilD et crgA ont ŽtŽ individualisŽs. Une tr�s bonne corrŽlation sur plus de 200 souches a ŽtŽ observŽe entre les rŽsultats obtenus par cette technique et ceux obtenus par la MLEE. Chaque groupe clonal de souches se trouve dŽsignŽ par un all�le pilA, un all�le pilD et un all�le crgA spŽcifiques. LÕŽtude du polymorphisme des g�nes pilA, pilD et crgA nous a permis de caractŽriser plusieurs foyers dÕinfections mŽningococciques en France entre 1995-1999. Les rŽsultats sont en accord avec une situation globalement endŽmique des infections mŽningococciques en France avec des souches hŽtŽrog�nes. Cependant, dans un cas, nous avons pu montrer quÕil sÕagissait dÕun foyer local et clonal correspondant ˆ une seule souche. Etude du polymorphisme du g�ne penA pour la dŽtection des souches de sensibilitŽ diminuŽe ˆ la pŽnicilline.

Nous avons recensŽ d�s 1998, une proportion importante de souches de sensibilitŽ diminuŽe au seuil de 0,125mg/L (environ 30% des souches). Le principal mŽcanisme connu est lÕaltŽration du g�ne penA codant des protŽines liant la pŽnicilline, secondaire ˆ lÕacquisition, par transformation, de g�nes mosa•ques des Neisseria commensales du tractus respiratoire (N. flavescens, N. cinerea). Notre objectif est de tenter dÕidentifier des sŽquences consensus de ces g�nes qui permettraient dÕŽtablir un diagnostic gŽnotypique et une possible dŽtection par PCR.

GŽnŽtique de la virulence de N. meningitidis (M-K Taha).

Le processus pathog�ne des mŽningococcies implique d'abord l'adhŽsion des bactŽries aux cellules ŽpithŽliales. Celle-ci est dominŽe par l'action des pili. La protŽine PilC1 joue un r™le majeur dans l'assemblage des pili ainsi que dans l'adhŽsion aux cellules. Le g�ne pilC1 poss�de une rŽgion promotrice spŽcifique nŽcessaire ˆ l'induction de l'expression de ce g�ne lors du contact bactŽries/cellules. Un nouveau rŽgulateur transcriptionnel a ŽtŽ identifiŽ, le g�ne crgA de la famille de lysR, de N. meningitidis, et dont l'expression est induite par le contact avec la cellule cible en m�me temps que pilC1. Ce g�ne semble intervenir dans le contr™le de lÕadhŽsion bactŽrienne aux cellules cibles et en particulier lors de contact intime entre la bactŽrie et la cellule. Ces dŽterminants d'adhŽsion jouent Žgalement un r™le important aux Žtapes d'invasion des vaisseaux sanguins par l'activation du TNF dans les cellules endothŽliales en prŽsence de monocytes.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Pascale VIENNE

Chercheurs de l'unité

Jean-Michel ALONSO
Muhamed-Kheir TAHA
Mireille LARRIBE

Stagiaires de l'unité

Aude ANTIGNAC
Ala Eddine DEGHMANE

Autre personnel de l'unité

Magaly DUCOS
Dario GIORGINI
Annie GUIYOULE
RenŽ PIRES

Publications de l'unité