Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Mycologie pour l'année 1999


Responsable : DUPONT Bertrand (bdupont@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les mycoses systémiques posent d’importants problèmes diagnostiques et thérapeutiques. Une meilleure connaissance de la physiopathologie et de l’épidémiologie de ces infections pourrait améliorer leur pronostic. Nous centrons nos recherches sur la pathogénicité de Cryptococcus neoformans et de Candida albicans, par une approche de l’hôte (étude épidémiologique, modèle animal) et du pathogène (facteur de virulence, adaptation à l’environnement, micro-évolutions).

Abstract

Early diagnosis and efficient treatment are the major problems for most of the mycoses. Increasing our knowledge on the pathophysiology and the epidemiology of these infections should improve their prognosis. We have focused our research on the pathogenicity of Cryptococcus neoformans and Candida albicans by studying both the host (epidemiological studies, animal models) and the pathogen (virulence factor, microevolution, adaptation).

Texte du rapport

L’étude de la physiopathologie des cryptococcoses et des mécanismes de virulence de Cryptococcus neoformans représente à terme les meilleurs moyens d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cryptococcose, en nombre important puisque cette infection opportuniste touche 2 à 30 % des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine à travers le monde. C. neoformans est une levure basidiomycète capsulée qui provoque des méningo-encéphalites de pronostic sévère malgré les traitements antifongiques (* 20 % de mortalité), ce qui justifie la recherche de mesures thérapeutiques ou prophylactiques nouvelles.

Etude Crypto A/D (F. Dromer, O. Lortholary, O. Ronin)

Une étude clinique multicentrique nationale sur la physiopathologie des infections dues à C. neoformans a débuté en avril 1997. Cette étude permet de rassembler des données cliniques et épidémiologiques sur les patients infectés par C. neoformans consentant à participer à ce protocole. En parallèle, les souches de cryptocoques ont été conservées et des liquides biologiques sont prélevés pour une étude de la réponse humorale et des profils de cytokines au moment du diagnostic et après 15 jours et 3 mois de traitement. L’analyse des différents paramètres se fera au décours des 4 ans de l’étude.

Etude de la réponse inflammatoire au cours de la cryptococcose (O. Lortholary, L. Improvisi, F. Dromer)

Nous avons pu montrer que la réponse inflammatoire plasmatique de l’hôte infecté par C. neoformans (homme et souris) est modérée par rapport à ce que l’on observe au cours des infections bactériennes et reflète la dissémination de l’infection et en particulier la fongémie. Par ailleurs, nous avons établi la pertinence du modèle expérimental par rapport à l’infection humaine, ce qui nous permet d’explorer des paramètres mal maîtrisables chez l’homme et en particulier la virulence de souches mutantes sélectionnées au laboratoire. Nous sommes actuellement en train d’étudier la réponse immunitaire locale au cours de la méningite cryptococcique chez les patients infectés ou non par le VIH.

Etude de la réponse humorale contre des protéines de C. neoformans (S. Neuville, R. Fermin, G. Janbon, F. Dromer)

Nous avons étudié la cinétique de production des anticorps anti-protéines de C. neoformans dans le modèle murin en utilisant une technique de prélèvements itératifs et une immuno-empreinte sur extraits cytosoliques et membranaires du champignon. Nous avons pu mettre en évidence l’existence d’anticorps préférentiellement produits par les animaux qui survivaient à l’infection tandis que d’autres étaient au contraire plus fréquemment synthétisés par ceux qui allaient mourir. Nous sommes actuellement en train d’identifier une protéine impliquée dans la réponse humorale des animaux qui survivent à l’infection cryptococcique. Cet outil nous permettra de mettre au point des tests éventuellement prédictifs du pronostic de l’infection, et pourra entrer dans la composition d’un vaccin.

Etude de la variabilité génotypique et phénotypique des souches de C. neoformans (D. Garcia-Hermoso, F. Dromer, G. Janbon)

Nous avons mis au point et standardisé différentes méthodes de typage moléculaire des souches de C. neoformans mettant en évidence une variabilité génotypique des souches chez les patients infectés par C. neoformans. En utilisant ces techniques de typage et un échantillonnage de souches raisonné nous mettons au point une méthode statistique permettant de déterminer si deux souches sont épidémiologiquement liées. Nous avons par ailleurs montré que la variabilité génotypique s’accompagnait d’une variabilité phénotypique des souches cliniques. Nous étudions la variabilité des phénotypes classiquement associés à la virulence de C. neoformans. Enfin, nous étudions la dynamique de cette variabilité de souches dans un modèle de cryptococcose murine.

Etude des gènes de la capsule de C. neoformans (B. Klaproth, F. Provost, L. Improvisi, F. Dromer, G. Janbon)

Nous avons observé une grande variabilité de structure du polysaccharide de la capsule. Le but du projet est de comprendre l’influence de la structure de la capsule et de sa variabilité sur la virulence de C. neoformans et sur la physiopathologie de la cryptococcose. En utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques d’épitopes polysaccharidiques, nous avons isolé, après mutagénèse, une grande collection de souches mutantes à structure de capsule modifiée. Un gène nommé CASI qui est nécessaire à la synthèse d’un épitope polysaccharidique de la capsule a été cloné. Caslp est une protéine membranaire dont la séquence ne présente aucune homologie avec des protéines connues. En revanche, nous avons identifié des orthologues de CASI chez des organismes supérieurs (Arabidopsis thaliana, homme, drosophile). La délétion de CASI influence la virulence de C. neoformans dans un modèle murin. Pourtant, ceci ne pourra être compris que si l’on connaît la fonction exacte de cette protéine lors de la biosynthèse de la capsule. En ce sens, nous étudions la structure des capsules des souches mutantes et nous clonons de nouveaux gènes impliqués dans ces voies de biosynthèse.

Candida albicans, une levure ascomycète saprophyte du tube digestif, est le deuxième microorganisme étudié dans l’Unité de Mycologie. Les infections dont elle est responsable sont de gravités diverses. De nombreux aspects physiopathologiques et épidémiologiques restent encore inconnus.

Etude des vaginites récurrentes dues à Candida albicans (L. Improvisi, F. Dromer, G. Janbon)

Ce travail s’inscrit dans le cadre du Centre National de Référence. Nous utilisons une technique de typage moléculaire (VNTR) pour rechercher si la même souche est responsable des épisodes successifs de vaginite et pour étudier la particularité génétique des souches responsables des vaginites récurrentes par rapport aux souches isolées au cours d’épisodes uniques.

Mise au point de modèles animaux de candidose (L. Improvisi, F. Dromer)

Dans le cadre d’un réseau national d’étude de Candida albicans, nous développons de nouveaux modèles expérimentaux permettant de tester la virulence de souches mutantes sélectionnées par d’autres équipes. Le modèle de colonisation digestive nous permet en particulier d’étudier, en collaboration avec l’équipe de Daniel Poulain à Lille, l’implication des sucres pariétaux dans la virulence des souches, en particulier celle des beta-oligomannosides.

Etude des gènes régulant l’assimilation du L-sorbose chez Candida albicans (G. Janbon)

L’instabilité génétique de C. albicans se manifeste par de simples ou multiples réarrangements chromosomiques ainsi que par l’apparition d’un certain nombre de phénotypes. Un lien causal a pu être établi entre les deux phénomènes à travers l’étude d’un modèle, l’assimilation du L-sorbose. Le L-sorbose est un composé toxique pour C. albicans et les phénotypes Sou+ et Sou- semblent directement déterminés par la présence de une ou de deux copies respectivement, d’un hypothétique gène nommé CSUI codant pour un facteur de transcription agissant négativement en trans sur le niveau de transcription du gène de structure responsable de l’assimilation du L-sorbose (SOUI) et situé sur le chromosome 5. Nous avons cloné 3 fragments d’ADN, qui lorsqu’ils sont présents en un nombre de copies suffisant, semblent réprimer la croissance des transformants sur L-sorbose. Ces régulateurs potentiels sont en cours d’étude.

Centre National de Référence des Mycoses Humaines et des Antifongiques.

Son activité comprend plusieurs aspects : l’étude de l’épidémiologie des infections fongiques, et en particulier celles dues à C. neoformans, Candida albicans et Histoplasma capsulatum à travers des réseaux de correspondants à l’échelle nationale ou européenne ; l’étude de la sensibilité des souches de champignons filamenteux et de levures aux antifongiques et la surveillance de l’évolution des profils de sensibilité en fonction des espèces au cours du temps ; l’identification des champignons pathogènes pour l’homme ; la réalisation des sérologies spécifiques dans le cadre du diagnostic ou de la surveillance des mycoses exotiques ; enfin, l’évaluation de nouvelles molécules antifongiques in vitro et dans des modèles animaux et l’évaluation de tests diagnostiques.

Etude du génome mitochondrial de Trichophyton rubrum (C. de Bièvre)

Trichophyton rubrum est l'agent principal isolé des lésions de l'ongle et de la peau chez l'homme. Disparu du milieu extérieur depuis un temps indéterminé, il était intéressant d'étudier son génome mitochondrial qui contient une grande partie des gènes ayant un rôle dans la respiration et la production d'énergie nécessaires aux synthèses de la matière cellulaire. Le séquençage de l'ADN mitochondrial a permis de connaître la totalité des gènes situés sur l'unique chromosome. Leur ordre sur le génome et leur séquence (ordre et type de bases) présentent de grandes similitudes avec ce qui est observé chez Aspergillus nidulans, mais avec toutefois une réduction des zones intergéniques et dans le nombre d'introns [séquence d'ADN, située à l'intérieur d'un gène (gène en mosaïque) qui est éliminée lors de la transcription en ARN messager].

Services rendus

L’Unité de Mycologie assure aussi plusieurs activités de service : une collection essentiellement consacrée aux champignons pathogènes pour l’homme et l’animal et un Cours de Mycologie Médicale destiné aux biologistes et aux cliniciens qui veulent se spécialiser dans l’étude et le diagnostic des champignons pathogènes. L’Unité est associée au Centre National de Référence des Mycoses Humaines et des Antifongiques.

Mots clés : Cryptococcus neoformans, Candida albicans, physiopathologie, épidémiologie, facteurs de virulence

Serveurs :      http://www.acs.ucalgary.ca/~cmody/
                http://alces.med.umn.edu/Candida.html

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LECARPENTIER Laurette, IP

Chercheurs de l'unité

DE BIEVRE Claude, IP
DROMER Françoise, IP
JANBON Guilhem, IP

Stagiaires de l'unité

FERMIN Romuald, DESS
GARCIA-HERMOSO Dea, thèse
KANSAU Imad, post-doctorant
KLAPROTH Birgit, stagiaire
LORTHOLARY Olivier, PU-PH
NEUVILLE Ségolène, thèse
LOYER Clarisse, médecin d’études cliniques

Autre personnel de l'unité

CHEVRIER Geneviève, IP
COUTANSON Monique, IP
IMPROVISI Luce, CNRS
PROVOST Frédérique, IP
RONIN Olivier, IP

Publications de l'unité

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