Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Membranes bactériennes pour l'année 1999

CNRS URA 2172


Responsable : WANDERSMAN Cécile (cwander@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Notre thème de recherche majeure concerne la sécrétion des protéines dépourvues de peptide signal par la voie ABC chez les bactéries à Gram négatif. Ces transporteurs sont constitués de trois protéines de l’enveloppe bactérienne : la protéine ABC proprement dite, une ATPase membranaire très conservée et deux protéines auxiliaires. L’interaction du signal C-terminal de l’exoprotéine avec la protéine ABC induit la formation d’un complexe multiprotéique comprenant les trois protéines du transporteur. Cette interaction requiert des protéines chaperons tels que SecB ou DnaJ suivant les substrats. Parmi les exoprotéines secrétées par cette voie, il existe une nouvelle famille d’hémoprotéines, les hémophores capables de fixer l’hème avec une très grande affinité et de le délivrer à un récepteur spécifique de la surface bactérienne avec lequel ils interagissent. La structure tridimensionnelle de l’hémophore a été réalisée et montre par les résidus en interaction avec l’hème qu’il s’agit d’un nouveau type de coordination de l’hème.

Abstract

Our major research concerns the secretion of proteins lacking a N-terminal signal peptide by ABC exporters which consist of three cell envelope proteins : the ABC protein, a highly conserved membrane ATPase and two helper envelope proteins. Binding of the exoprotein C-terminal secretion signal to the ABC protein triggers the association between the three secretion proteins. Chaperones such as SecB or DnaJ are required for interaction between the ABC protein and the substrate. Among the exoproteins using this secretion pathway there is a new family of hemoproteins that we called hemophores able to bind free or protein bound heme and deliver it to specific receptors. Interaction with the receptor involves protein-protein contacts. The S.marcescens hemophore is a monomer which binds heme with a stoechimetry of 1 and an affinity lower than 10-9M. The holoprotein has been crystallised showing a unique module with the two residues in interaction with heme.

Texte du rapport

I - ETUDE DE LA SECRETION DES PROTEINES CHEZ LES BACTERIES A GRAM NEGATIF PAR LES TRANSPORTEURS ABC (Rachel Binet, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire, Guillaume Sapriel)

Initialement, c’était le seul thème de recherche de l’équipe qui est devenue l’Unité des Membranes Bactériennes en 1999. Les transporteurs ABC sécrètent des protéines dépourvues de peptide signal N-terminal et sont caractérisés par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire ayant un domaine de fixation de l'ATP appelé ABC (pour ATP Binding Cassette) très conservé. Les protéines ABC forment une des plus grandes familles de protéines du monde vivant. Présentes aussi bien dans les membranes plasmiques que dans les membranes d'organelles, elles interviennent dans toutes sortes de transports parfois essentiels à la survie de l'organisme, comme le montre la liste sans cesse plus longue des maladies génétiques graves liées à des altérations de protéines ABC. Notre équipe a contribué à montrer que cette voie de sécrétion est présente chez plusieurs espèces bactériennes, qu'elle permet la sécrétion de protéines très diverses ayant toutes un signal C-terminal d'environ 50 acides aminés et que les transporteurs comprennent outre la protéine ABC, deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne. Le signal de sécrétion sur l'exoprotéine reconnaît la protéine ABC dont l'activité ATPasique est modulée par cette interaction, qui "in vivo" induit la formation d'un complexe multiprotéique, ordonné, comprenant les trois protéines du transporteur. La sécrétion requiert des chaperons cytoplasmiques dont la nature est fonction des substrats sécrétés. Ces chaperons, outre leur rôle dans le dépliement des exoprotéines, pourraient aussi avoir des fonctions d'adressage vers la protéine ABC du transporteur. Nos objectifs sont de déterminer les changements conformationnels induits par l’interaction entre les substrats et la protéine ABC, préciser le ou les rôles des chaperons et comparer les états conformationnels des substrats avant pendant et après la sécrétion. Au cours de l’année 1999 - début 2000, Philippe Delepelaire a montré le rôle du chaperon DnaJ dans la sécrétion de l’hémolysine (P. Delepelaire, manuscrit soumis) alors que c’est le chaperon SecB qui est nécessaire à la sécrétion de l’hémophore HasA, un autre substrat de la voie ABC. Guillaume Sapriel a montré que " in vivo ", SecB permet ou stabilise l’interaction entre l’hémophore HasA et la proteine ABC. A l’aide de protéines hybrides ayant l’extrémité N-terminale de la b galactosidase fusionnée à des fragments de protéine HasA de taille décroissante tronqués à leur extrémité N-terminale, il a montré que l’interaction SecB-HasA-protéine ABC faisait intervenir les 10 premiers acides aminés de HasA. En l’absence du transporteur, toute la protéine HasA qui s’accumule à l’intérieur des bactéries est sous une forme active capable de fixer l’hème. Laurent Debarbieux teste actuellement si ce repliement est compatible avec la sécrétion en comparant l’efficacité de la sécrétion de protéines HasA synthétisées avant ou après la mise en place du transporteur.

II - ETUDE DES SYSTEMES BACTERIENS D’ACQUISITION DE L’HEME DEPENDENT D’HEMOPHORES EXTRA-CELLULAIRES (Emmanuel Dassa, Philippe Delepelaire, Julie Deleule, Jean-Marc Ghigo, Sylvie Létoffé, Annick Paquelin, Sylvia Rossi)

C'est en étudiant une protéine sécrétée par cette voie que nous avons identifié une nouvelle famille d'hémoprotéines présentes chez diverses bactéries à Gram négatif (Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens et Yersinia pestis). Ces protéines que nous avons appelées hémophores par analogie avec les sidérophores, captent l'hème libre ou associé à des protéines comme l'hémoglobine, l'hémopexine ou la myoglobine et le délivrent à des récepteurs spécifiques de la membrane externe. Leur rôle biologique est donc de capter l'hème de différentes hémoprotéines et de le délivrer à un récepteur spécifique. Alors que le récepteur est indispensable à l'acquisition de l'hème, l'hémophore ne l'est pas mais optimise le système, réduisant la concentration minimale de substrat requise et élargissant le spectre des hémoprotéines substrats potentiels (8). L'hémophore HasA de S. marcescens est un monomère qui fixe une molécule d'hème avec une très grande affinité (<10-9M). Nos objectifs sont de comprendre les mécanismes moléculaires de ce système original de captation de l’hème chez les microorganismes et le fonctionnement de cette nouvelle famille d’hémoprotéines dont il semble exister un homologue (de fonction encore inconnue) chez l’homme. C’est un travail que nous menons en collaboration avec plusieurs équipes dont 4 à l’Institut Pasteur (Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire, Laboratoire d'Ingénierie des anticorps (qui a remplacé l'Hybridolab), Laboratoire des Yersinia, Unité de Biochimie cellulaire) et avec plusieurs équipes françaises (à Marseille les équipes de Cristallographie AFMB-CNRS ( M. Czjek) UPRESA-CNRS, UFR de Pharmacie (R. Gilli), Bioenergétique et Ingénierie des Protéines (B. Guigliarelli), et à Paris le CHU Kremlin Bicêtre (Michael Marden), et internationales (Constance, RFA (W. Welte), Atlanta, USA (I. Stojiljkovic), Tanabe, Japon (K. Omori).

  1. Mécanismes de fixation de l’hème à l’hémophore. (Emmanuel Dassa, Sylvie Létoffé en collaboration avec les groupes de RMN de Pasteur, de biochimie structurale du CNRS, Marseille)

Au cours de l’année 99, la structure tridimentionnelle de l'holoprotéine a été déterminée à Marseille montrant un seul domaine composé de 4 hélices a de 7 brins b organisés en feuillets anti-parallèles. Le site de fixation de l'hème est très exposé au solvant et est formé par deux boucles flexibles avec une histidine (32) et une tyrosine (75) comme ligands axiaux du fer ferrique. Une deuxième histidine (83) pourrait aussi être impliquée dans la fixation de l'hème (1). Par mutagénèse dirigée, Sylvie Létoffé a modifié chacun de ces trois résidus en alanine et également construit les mutants comportant les doubles et triples substitutions. Clarisse Deniau et Anne Lecroisey du laboratoire de RMN ont mesuré les affinités de ces mutants. Les simples mutants gardent une très grande affinité pour l’hème (10-9M) alors que les doubles mutants sont plus affectés. Parmi ceux ci, c’est le double mutant H32-A-Y75-A qui a la constante de dissociation la plus élevée (10-5M). Emmanuel Dassa est en train de déterminer celle du triple mutant. Des résultats préliminaires indiquent qu’il aurait perdu toute affinité. Par microcalorimétrie, des expériences de compétition entre protéine HasA sauvage et mutantes ont permis d’avoir une valeur précise (10-11M) du Kd de l’hémophore sauvage pour l’hème. Seul le double mutant 32-75 (et probablement le triple en cours d’analyse) a perdu toute activité biologique de restitution de l’hème au récepteur.

2. Mécanisme de fixation de l’hémophore sur son récepteur. (Sylvie Létoffé, en collaboration avec K. Omori - Tanabe, Japon, Farida Nato - Hybridolab Pasteur)

Sylvie Létoffé a montré que l'interaction entre l'hémophore et son récepteur HasR ne se fait pas par l'hème seulement, mais implique une interaction protéine-protéine de très haute affinité (kd< 0.1nM) (6). L’inhibition du fonctionnement de la protéine sauvage par le variant H32-Ala- Tyr75A confirme ce résultat. L’étude des hémophores sécrétés par d’autres espèces bactériennes (P. fluorescens et P aeruginosa) a révélé qu’ils pouvaient être fonctionnels dans un système héterologue reconstitué chez E. coli comprenant le récepteur de S. marcescens, mais l’activité s’observe uniquement après clivage de leurs extrémités C-terminales. Par coimmunoprécipitation et " dot blot ", Sylvie Létoffé a montré qu’ en l’absence de clivage, ces hémophores n’interagissent pas avec le récepteur. A l’aide de variants de l’hémophore de P. fluorescens ayant des délétions du signal C-terminal et de protéines hybrides entre cet hémophore et celui de S. marcescens, nous avons montré qu’une région située juste en amont de l’extrémité C-terminale est requise pour les interactions entre hémophore et récepteur (manuscrit en cours de révision). En collaboration avec le Laboratoire d'Ingénierie des anticorps, nous avons obtenu 4 anticorps monoclonaux distincts dirigés contre HasA qui reconnaissent des épitopes conformationnels. Ils pourraient nous permettre d’étudier les changement de conformation que subit l’hémophore lors de son interaction avec le récepteur

3. Etude du récepteur de l’hémophore, HasR. (Philippe Delepelaire, Julie Deleule, Jean-Marc Ghigo, Sylvie Létoffé, Annick Paquelin, en collaboration avec Wolfram Welte (Constance – RFA), I. Stojiljkovic (Atlanta – USA)

Actuellement, on a identifié chez les bactéries à Gram négatif plus d'une centaine de récepteurs différents pour des composés contenant du fer ou de l'hème. Ils présentent entre eux un certain degré de similitude. Localisés dans la membrane externe et exposés à la surface cellulaire, leur fonctionnement est dépendent d'une protéine de la membrane interne TonB. (une protéine multifonctionnelle et très conservée chez les bactéries à Gram négatif). La structure tridimensionnelle de deux récepteurs de cette famille déjà cristallisés montre des protéines monomériques formant un tonneau b fermé du coté périplasmique par l'extremité N-terminale en interaction avec la protéine TonB. Le récepteur HasR par sa séquence homologue et son fonctionnement dépendant de la protéine TonB appartient à cette famille. Julie Deleule et Philippe Delepelaire ont entrepris sa purification en vue de sa cristallisation. Alors que la protéine TonB semble unique chez E.coli interagissant donc avec un grand nombre de récepteurs, chez S. marcescens, Annick Paquelin et Jean-Marc Ghigo ont identifié une protéine TonB spécifique dont le gène est localisé dans le même opéron que hasR et hasA. L’acquisition de l’hème peut se faire avec l’une ou l’autre de ces protéines TonB. Nous pensons que la quantité de protéine TonB pourrait être limitante pour permettre le fonctionnement simultané de plusieurs récepteurs. Nous avons étudié les propriétés de la protéine HasB chez E. coli. (manuscrit en préparation).

4. Régulation de l’expression de l’opéron has. (Sylvia Rossi, Jean-Marc Ghigo)

L’ensemble des gènes codant pour le récepteur HasR, l’hémophore HasA, une partie de son transporteur ABC et la protéine HasB sont situés dans un opéron réprimé par le répresseur Fur en présence de fer. On retrouve juste en amont du gène hasR une séquence opérateur appelée " boîte Fur " conservée dans la majorité des systèmes bactériens soumis à la régulation par la carence en fer. En amont de cette boîte Fur, il y a deux phases ouvertes de lecture appelées HasI et HasS présentant de fortes homologies de séquence avec des facteurs sigma et anti-sigma intervenant dans la régulation des fonctions extracytoplasmiques (facteurs ECF) et particulièrement ceux impliqués dans l'acquisition du dicitrate de fer. Dans ce système, l'anti-sigma est une protéine de la membrane interne qui séquestre le facteur sigma. Elle est modifiée lors du passage du citrate de fer par le récepteur de membrane externe et libère le facteur sigma. Cette modification et donc l'induction sont dépendantes de TonB qui fournit probablement l'énergie nécessaire au changement conformationnel du récepteur de membrane externe. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle des gènes hasI et hasS dans l'acquisition de l'hème chez S. marcescens. Sylvia Rossi a construit une fusion transcriptionnelle hasR-lacZ chez S.marcescens et montré que le gène hasI est bien un régulateur positif de l’opéron has. Nous faisons l'hypothèse que c’est l’hémophore qui en se fixant sur le récepteur induit la cascade d’activation. Ceci permettrait le maintien de l’homéostasie intracellulaire de l’hème. A forte concentration en hème, le système serait faiblement exprimé et l’hème entrerait de façon peu efficace par le récepteur. A faible concentration en hème, il n’y a pas d’hème libre, tout l’hème est fixé sur HasA qui induit l’opéron ce qui permet une acquisition de l’hème très efficace.

5. Mécanisme permettant à l’hémophore l’extraction de l’hème présents sur différentes hémoprotéines. (Sylvie Létoffé, en collaboration avec Michel Goldberg, Institut Pasteur et Michael Marden, CHU Kremlin Bicêtre)

Au cours de l'année 1999 nous avons recherché en collaboration avec le laboratoire de M. Goldberg la formation d'un complexe stable entre HasA et l'hémoglobine humaine par ultracentrifugation analytique. Un mélange équimolaire de apo-HasA et d'hémoglobine a été analysé de cette façon. Il y a eu une conversion complète de l'apo-HasA en holo-HasA mais sans détection d'un complexe stable hémoglobine-HasA avec un poids moléculaire attendu de 90 Kda (6). Cependant cette expérience était longue et n’aurait pas permis de voir un complexe fugace. M. Marden a repris ces expériences en mesurant par spectrophotométrie cinétique le transfert de l’hème depuis l’oxyhémoglobine et la methémoglobine à l’apoprotéine HasA. Les résultats préliminaires indiquent qu’il n’y a pas d’accélération de la libération de l’hème de l’hémoglobine par l’addition de HasA, ce qui confirme que l’hémophore n’interagit pas physiquement avec ses substrats, mais capte l’hème du fait d’une plus forte affinité.

6. Etude des autres hémophores. (Jean-Marc Ghigo, Sylvie Létoffé, Sylvia Rossi, et en collaboration avec Elisabeth Carniel, Institut Pasteur)

Sylvia Rossi a cloné le gène hasA de Y. pestis. Il est exprimé et secrété chez E.coli par le transporteur ABC de S. marcescens, ce qui nous a permis de purifier la protéine et de faire des anticorps chez le lapin dirigés contre elle. La protéine fixe l’hème, mais n’est pas fonctionnelle avec le récepteur HasR de S. marcescens. Nous sommes en train d’inactiver le gène chez Y. pestis afin de déterminer en collaboration avec Elisabeth Carniel le rôle de l’hémophore dans le pouvoir pathogène de cette bactérie extrêmement virulente.

III - FORMATION DES BIOFILMS BACTERIENS (Jean-Marc Ghigo)

Jean-Marc Ghigo souhaite développer un nouveau sujet de recherche sur la formation des biofilms bactériens. Le thème de ce projet est l'étude des gènes bactériens induits par l'adhésion à des surfaces solides comme les prothèses médicales et tout particulièrement les matériaux utilisés pour les prothèses ophtalmologiques puisque ce projet implique mon laboratoire et le service d'ophtalmologie de l'Hôtel Dieu. Notre but est d'analyser les premières étapes de l'adhésion et de la formation des biofilms sur supports solides. Jean-Marc Ghigo a commencé avec E. coli et S. marcescens comme bactéries modèles. Après avoir mis au point des conditions reproductibles de formation de biofilms, il a construit un vecteur permettant de sélectionner les gènes exprimés dans les biofilms (type IVET) et il commence l’analyse sur filtre de haute densité des ARN messagers fait spécifiquement dans les biofilms.

MOTS CLES
Sécrétion des protéines
Protéines membranaires
Hémoprotéines
Acquisition du fer et virulence bactérienne

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

FERRAND Monique, IP
MEUNIER Yolande, IP

Chercheurs de l'unité

DELEPELAIRE Philippe, CNRS
GHIGO Jean-Marc, IP

Stagiaires de l'unité

BINET Rachel, Thèse
DASSA Emmanuel, DEA
DEBARBIEUX Laurent, Post-doctoral
DELEULE Julie, Thèse
ROSSI Maria-Silvia, Thèse
SAPRIEL Guillaume, Thèse

Autre personnel de l'unité

LETOFFE Sylvie, IP - Ingénieur
PAQUELIN Annick, CNRS - Technicien

Publications de l'unité

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