Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Signalisation immunoparasitaire pour l'année 1999

CNRS URA 1960


Responsable : LANGSLEY Gordon (Fax : 04 4061 3185, Tél. 01 4568 8922) (langsley@pasteur.fr)

Résumé du rapport

        La transformation lymphocytaire Theileria-dépendante est caractérisée par l’induction constitutive du facteur de transcription AP-1. Ceci est dû à l’activation constitutive de la kinase JNK et la phosphorylation permanente de c-Jun. Pour mieux comprendre les conséquences dans la transformation lymphocytaire de l’activation constitutive d’AP-1, nous avons établi les lignées B où l’expression d’un mutant dominant négatif de c-Jun est inductible. Bien que l’induction de c-Jun muté engendre l’inhibition d’AP-1, nous n’observons aucun arrêt dans la prolifération des lymphomes B. A contrario, l’inhibition d’AP-1 engendre une diminution importante dans la capacité des tumeurs de dégrader la matrice extracellulaire in vitro. Ceci implique directement l’induction d’AP-1 dans la métastase des lymphomes B. Puisque les lymphomes B Theileria- dépendent forment les tumeurs lorsqu’ils sont injectés chez les souris SCID, nous disposons d’un modèle in vivo pour confirmer le rôle d’AP-1 dans la métastase.
        Nous avons récemment mis en évidence l’existence d’une boucle de régulation autocrine basée sur la sécrétion de GM-CSF et son interaction avec son récepteur cellulaire. Cette boucle de régulation est impliquée dans la prolifération non-contrôlée des lymphocytes B transformés par Theileria. Par ailleurs, nous avons aussi démontré que la production du GM-CSF par les lymphomas B est régulée par une activation constitutive de PI3-K.
        L’inhibition des phosphoinositide 3’-kinases (PI3-K) par les drogues spécifiques (Ly294002 et wortmannin) engendre un arrêt de la prolifération dû au blocage d’entrée en phase S, une réduction dans l’activité transactivatrice d’AP-1, et un blocage dans le recyclage du récepteur à transferrine (TfR). Par transfection des mutants dits « transdominants-négatifs » nous avons démontré que l’activation d’AP-1 dépend de la PI3-K du type 1 (p110) et que le recyclage du TfR dépend de la PI3-K du type 3 (VPS34).
        L’endocytose est un processus essentiel des cellules eucaryotes permettant l’internalisation des macromolécules du milieu extracellulaire, la modulation des récepteurs de surface et plus généralement le maintien de l’homéostasie cellulaire. De nombreuses protéines régulant l’endocytose ont été récemment caractérisées dans les cellules de mammifères. Parmi elles, les GTPases de la famille Rab, en particulier Rab5 et Rab11, jouent un rôle essentiel. Rab5 est localisée sur les endosomes précoces et régule l’ancrage et la fusion de ces organelles. Il a récemment été montré que deux effecteurs importants de Rab5 sont la PI-3K et la protéine EEA1. La PI3-K, hVPS34, produit le PI(3)P et permet de recruter sur les membranes endosomales la protéine EEA1 en se liant au domaine « FYVE » de cette protéine. Le rôle de Rab11, présente sur les endosomes de recyclage, est moins bien connu. Elle pourrait cependant réguler le recyclage tardif des récepteurs de la transferrine après internalisation et/ou contrôler une voie de transport entre les endosomes et le réseau trans-Golgien (TGN). Notre équipe a commencé à identifier des gènes codant pour des homologues potentiels de Rab5 et Rab11 chez Plasmodium falciparum. D’autre part, notre analyse du génome de P. falciparum révéle l’existence de gènes codant pour un homologue de hVPS34 et pour une protéine contenant un domaine « FYVE », suggérant que toute la machinerie Rab5 dépendante régulant la fusion des endosomes est présente chez ce parasite. Nous avons également continué notre caractérisation de Rab6 du parasite et en particulier, nous avons pu obtenir la résolution de sa structure en trois dimensions.

Abstract

        Theileria-dependent transformation is characterised by the constitutive induction of the leukocyte transcription factor AP-1. Activation of AP-1 is uniquely due to the permanent activation of JNK which results in constant N-terminal phosphorylation of c-Jun. To better understand the contribution of AP-1 induction to leukocyte transformation we have established infected B cell lines, where the expression of dominant negative c-Jun is inducible by doxycyclin. Expression of the dominant negative c-Jun phenotype results in significant inhibition of AP-1, without any alteration in the proliferation of the transformed B cells. Importantly however, there is a 30% percent reduction in the capacity of the transformed B cells to degrade extra-cellular matrix, suggesting a role for AP-1 induction in metastasis. Since Theileria-transformed B cells form tumours when injected into Scid mice, we can analyse the contribution of AP-1 induction to metastasis in vivo.
        We have recently demonstrated that a GM-CSF autocrine loop contributes to the proliferation of Theileria-transformed B cells. Significantly, GM-CSF induction depends on parasite activation of host cell phosphoinositide 3’-kinase (PI3-K). Our observation that PI3-K activation is a feature common to all Theileria-transformed leukocytes, lead us to propose that PI3-K could be involved in the induction of different Theileria-dependent autocrine loops (GM-CSF for B cells & Il-2 for T cells etc.).
        Inhibition of PI3-K not only induces growth arrest, due to a block in S phase entry, a reduction in AP-1 activity, but it also leads to a block in the recycling of Transferrin Receptor (TfR). In transient transfection assays we have demonstrated that AP-1 activation depends on type I (p110a) PI3-K, whereas recycling of TfR involves type III PI3-K (vps34).
        Endocytosis is an essential process of eukaryotic cells which permits the internalisation of macromolecules and the regulation of receptor expression at the surface. A number of different proteins are involved in regulating endocytosis and in particular, the GTPases Rab5 and Rab11 appear to play important roles. Rab5 is located on early endosomes together with the lipid kinase vps34 and its effector EEA1. Vps34 produces PI(3)P which recruits to Rab5-positive endosomes EEA1 via binding to its FYVE domain. The role of recycling endosomes is less well understood, but Rab11 could control late recycling of TfR, or control transport between endosomes and the trans-Golgi network (TGN). We have cloned and are beginning to characterise both Rab5 and Rab11 from the Human malaria parasite Plasmodium falciparum. Moreover, we have used bioinformatics to identify putative parasite homologues for vps34 and a FYVE domain containing protein, consistent with the notion that all of the elements necessary for regulation of Rab5-mediated endosomal traffic are encode by P. falciparum. We have also continued our characterisation of Rab6 and in particular, we have recently determined the crystal structure of Rab6-GDP.

Texte du rapport

Etude des mécanismes responsables de la prolifération cellulaire et ceux de la régulation du trafic membranaire au cours du processus de la transformation blastique induit par Theileria chez les lymphocytes bovins.

Les leucocytes infectés par Theiléria présentent les caractères propres des cellules tumorales et cela indépendamment du type cellulaire. Ils se multiplient en culture avec un index mitogénique élevé de façon indéfinie et cela, sans ajout de facteurs de croissance. Outre cette capacité de croissance illimitée, les cellules infectées acquièrent un phénotype transformé. En effet, leur injection à des souris immunodéficientes (souris SCID) provoque la formation de tumeurs. Un point important dans ce modèle d'immortalisation leucocytaire est la réversibilité de ce phénomène. En effet, le traitement des cellules infectées avec une drogue Theiléricide spécifique stoppe la prolifération et les lymphocytes hôtes redeviennent des cellules quiescentes. Les cellules infectées par Theileria représentent donc un modèle unique pour l'étude des mécanismes du contrôle d'activation et de transformation lymphocytaire.

Métastase et le facteur de transcription AP-1. (Marie Chaussepied)

        La progression tumorale est clairement favorisée par l'acquisition au niveau cellulaire du potentiel métastatique. En effet, l'acquisition d'un potentiel métastatique résulte de l'expression de certaines molécules (molécules d'adhésion, de la matrice extracellulaire, des protéases de dégradation de la matrice) conférant un phénotype métastatique. Par ailleurs, il faut souligner également que le phénomène métastatique résulte d'une interaction entre plusieurs facteurs (ie MMP, TIMP) qui jouent un rôle dans la vascularisation et l'angiogenèse tumorale1. Il est clair qu'une meilleure compréhension du rôle des facteurs nucléaires dans la régulation des modifications génétiques est importante dans le développement de nouvelles thérapies.
        Le facteur de transcription AP-1 est un dimère composé de protéines des familles Jun et Fos2. Le virus sarcomateux aviaire, ASV17 porte l’oncogene v-jun, le virus de l’osteosarcome murin FBJ, v-fos.3 La capacité transformante de leurs homologues cellulaires, c-jun et c-fos est documentée dans des lignées fibroblastiques4. Cependant, la localisation ubiquitaire de ces protéines, leur induction par de nombreux stimuli, notamment d’autres oncogenes, des agents carcinogenes suggèrent un rôle dans l’établissement de différents types tumoraux 5. Bien que les sites de liaison d’AP-1 ont été identifiés au niveau des régions promotrices de plusieurs gènes, le rôle d’AP-1 dans l’expression de gènes spécifiquement impliqués dans la régulation de la progression tumorale n’est pas encore établi. Ainsi, l’identification de gènes cibles d’AP-1 impliqués dans le phénomène métastatique est capitale, bien que des données récentes indiquent un rôle dans la régulation par AP-1 des gènes CD44 et MMP9.6
        L’activation d’AP-1 est contrôlée par une famille de protéine sérine/thréonine kinases, les MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases)7. Les promoteurs des gènes c-jun et c-fos sont occupés de façon constitutive et l’activité transactivatrice des complexes pré-formés est modulée par phosphorylation8. Les MAPK phosphorylent les facteurs de transcription c-Jun, ATF-2 et ELK-1 qui participent à l’activation transcriptionnelle des gènes c-jun et c-fos9. Outre c-Jun et ATF-2, les JNK peuvent phosphoryler ELK-1 et activer la transcription de c-fos10
        Une des manifestations cliniques caractéristiques des infections theilériennes est l’adénopathie généralisée11. La leucocytose et la lymphocytose qui l’accompagne sont le reflet de la prolifération incontrôlée d’immunoblastes sains et parasités12. Chez les animaux morts, l’examen histopathologique révèle la présence d’infiltrats d’immunoblastes parasités dans les tissus lymphoïdes et non lymphoïdes (foie, rein, encéphale). L’injection sous-cutanée de lymphoblastes parasités à des souris SCID entraîne la formation de masses tumorales liées à la prolifération in situ des cellules parasitées13. Injectées par voie intrapéritonéale, elles infiltrent le foie, les reins, les poumons14. Leur dissémination tissulaire dépend de l’induction permanente d’activités métalloprotéinases. En particulier, l’expression constitutive de la collagénase IV/MMP9, dont le promoteur humain contient deux sites AP-1 putatifs, a été associée à l’activation de ce facteur de transcription et au phénotype métastatique des cellules infectées15.
         La capacité métastatique des leucoytes infectés a été liée à la sécrétion de métalloprotéases de type MMP9 et l’induction de l’expression du gène mmp9 a été corrélée avec l’activation du facteur de transcription AP-116. L’activité transactivatrice AP-1 constitutive chez les lymphocytes B transformés par T. parva résulte de l’expression accrue, telle qu’évaluée par immunoblot à l’aide d’anticorps spécifiques, de tous les membres de la famille Jun, alors que parmi les protéines Fos, c-Fos est majoritairement induite17. L’induction des protéines Jun et Fos, et donc l’activité AP-1 dans les cellules infectées, dépend de la présence du parasite car est abolie dans les cellules traitées avec le BW720c [résultats non publiés]. Nous avons caractérisé les voies d’activation d’AP-1 et établi le rôle essentiel des MAP kinases du groupe JNK (c-Jun N terminal kinases)18. Aucune activité kinase p38 n’est détectée et l’état d’activation des MAPK du groupe ERK (Extra-cellular signal Regulated Kinase), qui phosphorylent ELK-1, a également été déterminé : les kinases ERK ne sont pas non plus activées dans les leucocytes transfomés par Theileria. Bien que l’état de phosphorylation de ELK-1 n’a pas été examiné, la sur-expression transitoire d’une protéine phosphatase, CL10019, spécifique des MAPK (JNK, ERK et p38), inhibe l’activité d’un gène rapporteur luciférase placé sous le contrôle du promoteur de c-fos et également un rapporteur contenant des sites AP-1 consensus, établissant un rôle essentiel des JNK dans l’induction d’AP-118.
        Le facteur de transcription AP-1 régule l’expression de certains gènes impliqués dans la métastase tels que les gènes de l’urokinase (uPA), le récepteur de l’urokinase (uPAR), le récepteur CD4420. Il a été montré que la localisation de l’uPA à la surface des cellules par l’intermédiaire de l’uPAR augmente leur capacité invasive ; de plus un effet paracrine de l’uPA sur des cellules exprimant le récepteur a été décrit21. CD44, le récepteur de l’acide hyaluronique, a été impliqué dans la motilité cellulaire, la métastase des cellules tumorales et récemment leur survie22. Par RT-PCR, nous avons déterminé le niveau d’expression de ces gènes, ainsi que les gènes des métalloprotéinases MMP2, MMP9 et des inhibiteurs de métalloprotéinases, TIMP1 et TIMP2 [résultats non publiés].
        Pour étudier le rôle d’AP-1 dans l’immortalisation et la transformation des lymphocytes, nous avons crée des lignées stables exprimant de façon conditionnelle un mutant de c-Jun humain délété de son domaine de transactivation23. La protéine tronquée se comporte comme un mutant dominant négatif : son expression inhibe l’activation d’AP-1 et l’apoptose dans des neurones sympathiques sevrés de facteurs de croissance ; de même, l’apoptose induite dans les fibroblastes murins NIH3T3 par la sur-expression de c-Jun est abolie dans les cellules transfectées avec ce mutant24. De plus, l’expression du mutant c-Jun D169 dans des fibroblastes embryonaires de poulet les rend dépendant du sérum pour leur prolifération et suite à l’inactivation du gène c-jun par mutation nulle, des cellule souches embryonaires perdent la capacité à former des tératocarcinomes quand elles sont injectées par voie sous-cutanées à des souris syngéniques25.
        Nous avons choisi le système inductive par la tétracycline décrit par Gossen et Bujard et établi deux clones, l’un exprimant le transactivateur tTA réprimé en présence de tétracycline (clone t1.4), l’autre, la transactivateur rtTA, activé par l’ajout de tétracycline (clone r6.12)26. L’ADN codant pour le mutant de c-Jun marqué avec l’épitope Flag (Flag c-Jun D169) a été sous-cloné dans un vecteur sous le contrôle du promoteur inductible/répressible par la tétracycline et possédant une cassette de résistance à l’histidinol. Cette construction a été transfectée dans les lignées t1.4 et r6.12. La sélection de clones résistants à l’histidinol a été réalisée en absence de doxycycline (un analogue de la tétracycline), c’est à dire dans un contexte d’expression (lignée t1.4) ou de répression (lignée r6.12) permanente du mutant. Dans ces deux situations, nous avons obtenu des clones positifs répressibles ou inductibles par la doxycycline.
        L’injection sous-cutanée de lymphoblastes parasités (dans lesquels nous avons également introduit la GFP) à des souris SCID entraîne la formation de masses tumorales qui injectées par voie intrapéritonéale infiltrent le foie, les reins, les poumons. Kistner et al ont montré que la doxycycline ajouté dans l’eau de boisson régule l’expression du gène de la luciférase placé sous le contrôle du promoteur inductible dans des souris transgéniques pour tTA ou rtTA27. Donc, l’eau de boisson des souris SCID contiendra, ou non, de la doxycycline et les nombres de tumeurs et leur localisation seront observés (et quantifiés par la GFP) dans les états induit et réprimé d’expression de c-Jun.

Maturation de CD44 à la surface des lymphocytes transformés.(Marie Chaussepied, Marie-Françoise Moreau)

Le facteur de transcription AP-1 régule l’expression de certains gènes impliqués dans la métastase tels que les gènes de l’urokinase (uPA), le récepteur de l’urokinase (uPAR), le récepteur CD4428. Il a été montré que la localisation de l’uPA à la surface des cellules par l’intermédiaire de l’uPAR augmente leur capacité invasive ; de plus un effet paracrine de l’uPA sur des cellules exprimant le récepteur a été décrit. CD44, le récepteur de l’acide hyaluronique, a été impliqué dans la motilité cellulaire, la métastase des cellules tumorales et récemment leur survie22. Nous avons caractérisé le niveau d’expression de CD44 sur nos lymphocytes B transformés par Theileria vis à vis le même lignée B non parasité et nous avons constaté que CD44 est maturé par les protéases sécrétées par les tumeurs. Des études de la maturation, en présence ou absence des inhibiteurs de protéases, a permis la mise en évidence de la classe sérine, plutôt que les métallo-protéases, dans le coupure de CD44. Notre hypothèse de travail est que la maturation de CD44 sur les lymphocytes transformés implique l’activation de plasminogéne en plasmine par l’urokinase sécrétée et que c’est la plasmine qui est, en partie, responsable de la maturation de CD44.

Les isoformes CD44 exprimées par des lymphocytes transformés.(Marie Chaussepied, Marie-Françoise Moreau)

        Le gène cd44 humain comprend 19 exons dont 10 subissent un épissage alternatif donnant naissance à des isoformes dites variantes29. Les exons variants codent pour des polypeptides insérés dans le domaine extracellulaire proximal à la membrane (exons 6 à 14) et un domaine cytoplasmique alternatif court (exon 18)29. L’insertion extracellulaire de domaines variants affecte la liaison de CD44 avec son ligant, l’acide hyaluronique30. Il a par ailleurs été montré que l’expression de certains variants dans des cellules non métastatique leur confère un potentiel métastatique31.
        Nous avons étudié par transcription inverse et amplification PCR entre les exons conservés 5 et 19 les transcrits CD44 présents dans des leucocytes transformés par Theileria et des cellules leucocytaires ou endothéliales non parasitées. Les différents produits de l’amplification PCR ont été clonés et séquencés. Toutes les cellules analysées transcrivent une isoforme dite standard ou hématopoiétique à queue cytoplasmique longue (contenant l’exon 19) et qui exclue les exons variants29. Des transcrits contenant des exons variants sont également amplifiés dans toutes les cellules examinées. La comparaison des transcrits amplifiés d’une lignée infectée, TBL3 (CD44 ex8-9 et CD44 ex13) avec la lignée parentale non infectée BL3 (CD44 ex8-9 et CD44 ex7) montre que la transformation par Theileria modifie l’expression de CD44 dans ces cellules. La lignée lymphocytaire B infectée TpM409B2 transcrit l’isoforme CD44ex14. L’existence d’anticorps spécifiques de cette isoforme cross-réactifs avec la protéine bovine nous permettra d’analyser son expression dans des cellules où le parasite a été tué. Avec la lignée TpM409B2 exprimant le mutant de c-Jun (voir ci-dessus) nous enviagerons d’analyser le role d’AP-1 dans la transcription d’isoformes variantes

L’activation de NF-kB assure la prolifération des lymphocytes transformés, mais n’est pas une réponse anti-apôptotique. (Marie Chaussepied)

Sachant que les radicaux libres induisent NF-kB, nous avons testé l'effet de trois inhibiteurs de radicaux libres sur l'activation de NF-kB engendrée par Theileria. Ces trois composants bloquent la transcription d'un gène rapporteur placé sous le contrôle de sites kB. Dans les conditions où l'activité NF-kB est abolie, ces inhibiteurs bloquent la prolifération des cellules infectées. Nous avons examiné si l'effet des inhibiteurs de radicaux libres sur la prolifération est lié à un arrêt du cycle cellulaire, ou à la mort par apôptose d'une partie des cellules. Une analyse du cycle cellulaire par FACS a démontré que l’inhibition de la prolifération est due à un blocage en phase G2/M et la mort par apôptose de cellules à lieu en phase G1. Pour clarifier le rôle de NF-kB dans la régulation du cycle cellulaire et l’apôptose, nous avons examiné le cycle de cellules transfectées par IkB, un inhibiteur spécifique de NF-kB. Dans les conditions ou IkBa réprime à 90% l'activité de NF-kB, nos cellules ne meurent pas d’apôptose, mais s’accumulent en phase G2/M. Notre hypothèse actuelle est que la mort par apôptose en phase G1 est dûe à une dérégulation du facteur de transcription E2F. Cette hypothèse est basée sur l’observation que l’induction de l’apôptose par E2F-1 depend de sa capacité de lier l’ADN sans le transactiver32 d’autre part dans nos lymphomas B les inhibiteurs de radicaux libres diminuent la formation des complexes E2F-ADN. Nous sommes entrain de tester cette hypothèse par l’inhibition d’E2F obtenue après transfections des mutants transdominants négatifs qui ne lient pas l’ADN. Nous examinerons également, le rôle de NF-kB dans la boucle autocrine (GM-CSF) que nous venons de décrire.

L’activation constitutive des phosphoinositide 3’-kinases du type 1 et type 2 : leurs rôles dans la signalisation et le recyclage du récepteur de transferrine (TfR). (Martin Baumgartner)

        Nous avons établi que le facteur de transcription AP-1 est induit en permanence dans les cellules transformées et son activation dépend de la présence des parasites vivants. De plus, l’induction d’AP-1 et la prolifération des lymphocytes transformés sont médiées, en grande partie, par l’activation constitutive des phosphoinositide 3’-kinases. L’inhibition des phosphoinositide 3’-kinases (PI3-K) par les drogues spécifiques (Ly294002 et wortmannin) engendre un arrêt de la prolifération dû au blocage d’entrée en phase S, une réduction dans l’activité transactivatrice d’AP-1, et un blocage dans le recyclage du récepteur de transferrine (TfR). Par transfection des mutants transdominants-négatifs nous avons démontré que l’activation d’AP-1 dépend de la PI3-K du type 1 (p110) et que le recyclage du TfR dépend de la PI3-K du type 3 (vps34).
        Nous avons remarqué que l’inhibition de la prolifération engendrée par Ly294002 et wortmannin a été, en partie, reversée par le rajout du surnageant de culture conditionné. Suite à une série de RT-PCR, nous avons constaté que les lymphocytes B transfomés ne sécrétent que de l’IL-10, TNF-a, TGF-b et GM-CSF; par ailleurs nous avons trouvé que la transcrption du GM-CSF dépendait de l’activité PI3-K (voir manuscrit en annexe). Puisque le promoteur du gène de GM-CSF contient des sites de fixation d’AP-1 et NF-kB33, nous avons examiné si la lipide kinase contrôle l’induction de ces deux facteurs de transcription. En effet, en utilisant les lignés stables où l’expression de la luciférase est sous le contrôle de ces deux facteurs, nous avons rajouté les inhibiteurs Ly294002 et wortmannin et constaté le degré d’inhibition : 75% pour AP-1 et 61.6% pour NF-kB.
        Normalement, la PI3-K du type 1 (p110) dans son état actif est associée à la membrane plasmique alors que la PI3-K du type 3 (vps34) est associée aux endosomes de recyclage34. Les produits de chaque kinase lient des domaines différents des protéines effectrices: les domains PH lient les PI(3,4,5)P3 de la kinase p110, et les domaines FYVE lient PIP335. Puisque nous avons démontré que l’activité globale de PI3-K (type1 et type2) dans nos lymphocytes transformés est parasite dépendante, la question se pose vis-à-vis quel type d’endosome (Rab5 et/ou Rab11) est impliqué dans le recyclage de la TfR chez les lymphocytes transformés.
        L’endocytose est un processus essentiel des cellules eucaryotes permettant l’internalisation des macromolécules du milieu extracellulaire, la modulation des récepteurs de surface et plus généralement le maintien de l’homéostasie cellulaire. De nombreuses protéines régulant l’endocytose ont été récemment caractérisées dans les cellules de mammifères. Parmi elles, les GTPases de la famille Rab, en particulier Rab5 et Rab11, jouent un rôle essentiel. Rab5 est localisée sur les endosomes précoces et régule l’ancrage et la fusion de ces organelles36. Il a récemment été montré que deux effecteurs importants de Rab5 sont la PI3-K du type III (p150-hVPS34) qui produit le PI3P et permet de recruter sur les membranes endosomales la protéine EEA1 en se liant au domaine « FYVE » de cette protéine37. Le rôle de Rab11, présente sur les endosomes de recyclage, est moins bien connu. Elle pourrait cependant réguler le recyclage tardif des récepteurs de la transferrine après internalisation et/ou contrôler une voie de transport entre les endosomes et le réseau trans-Golgien (TGN)38 et (Goud et al., résultats non publiés).
        Pour étudier le rôle de Rab5 et Rab11 dans ce processus nous avons construit des mutants dominants négatives (liées au GDP) de ces protéines. Nous avons d’abord vérifié le comportement de ces mutants par transfection des cellules HeLa et l’effet sur le turnover de la TfR chez les cellules B transformées est en train d’être analysé par FACS.
        En parallele, en collaboration avec le Dr. Graça Raposo (Institut Curie, CNRS UMR 144, Compartimentation et Dynamiques Cellulaires) nous avons entrepris d’analyser par immunocytochimie en microscopie électronique la localisation de la protéine Rab11 dans les lymphocytes B transformés par Theleiria. Pour ce faire nous avons utilisé les méthodes d’ultracryomicrotomie et de marquages à l’or colloidal qui permettent de conjuguer de façon optimale la préservation de l’ultrastructure des compartiments cellulaires et la localisation des macromolécules. En bref, les coupes de cellules congelées sont incubées avec les différents anticorps dirigés contre les protéines d’interêt. Ces anticorps sont visualisées avec de la protéine A couplée à des particules d’or colloïdal de 5, 10 ou 15nm.  En utilisant cette approche nous montrons que la protéine Rab11 est détectée à la face cytosolique de petites vésicules et de compartiments tubulovésiculaires qui sont morphologiquement similaires aux endosomes précoces. En réalisant des doubles marquages avec des anticorps anti-Rab11 et des anticorps dirigés soit contre le TfR, soit contre la protéine EEA1 (tous deux connus comme transitant majoritairement au niveau des endosomes précoces) nous avons montré que 70% des compartiments Rab11 positifs, portent l’un ou l’autre des marqueurs. Ces compartiments correspondent ainsi au réseau endosomial précoce.
        Le fait que nous avons pu detecter la protéine Rab11 en microscopie électronique montre que le niveau d’expression de cette protéine est exceptionnelle dans ces cellules B et suggère que la transformation par Theleiria induit des remaniements importants de la voie d’endocytose et en particulier, du réseau endosomial précoce (endosomes de recyclage?).

Mots-clés : theileria, transformation, AP-1, GM-SCF, PI3-K

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

HOUSSIN Wendy, IP, (whoussin@pasteur.fr)

Chercheurs de l'unité

LANGSLEY Gordon, DR2 CNRS (langsley@pasteur.fr) GARCIA Alphonse, Chargé de Recherche, IP (agarcia@pasteur.fr)

Stagiaires de l'unité

BAUMGARTNER Martin, étudiant en thèse (argos@pasteur.fr) CHAUSSEPIED Marie, étudiante en thèse (mchauss@pasteur.fr) HILALY Sophie, étudiante en DEA (shilaly@pasteur.fr) QUEVILLON Emmanuel, étudiant en DESS (quevie02@pasteur.fr)

Autre personnel de l'unité

MOREAU Marie-Françoise, assistant-ingénieur CNRS

Publications de l'unité

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