Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Résonance Magnétique Nucléaire pour l'année 1999

CNRS URA 1129


Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les thèmes développés dans le laboratoire de RMN le sont en étroite collaboration avec les équipes de l'Institut Pasteur et sont les suivants : relations structure-fonction des molécules biologiques, reconnaissances moléculaires du type ADN-protéine, protéine-protéine

Abstract

The research area of the NMR laboratory is mainly dedicated to the structure determination of proteins, peptides and nucleic acids in solution in relation with their function but also to molecular interactions studies such as DNA-protein, protein-protein and peptides-macromolecules.Thus, the following studies have been initiated: (i) The conformational study in solution by NMR of the protein HasA from Serratia marcescens in its apo- form and by X-Ray in its holo- form. HasA is a proteineous siderophore able to bind the free heme as well as to capture it from hemoproteins; (ii) the conformational studies of scorpion venom toxins specific of potassium or sodium channels to understand their species specificity; (iii) the structural study of the Tyr tRNA C-terminal domain for which no structural information was available and that adopts a new type of fold for proteins of this family (iv) the project on DNA structure concerning the conformational study of the HIV activator domain that binds the transcription factor NF-kB and of its mutated sequence has been pursued allowing us to propose a new mode of binding; (v) the characterization of the DNA distortion in the DNA:protein complex formed with the SRY protein HMG domain and this by using phosphorus NMR; (vi) structure and dynamics of protein with antipaludic activity ; (vii) structural studies od antigenic determinants recognized by proctective monoclonal antibodies; (viii) Finally, we have followed our investigations on small sample volume probes as applied to biological NMR.

Texte du rapport

Etudes fonctionnelles et structurales de protéines impliquées dans les mécanismes d'acquisition de l'hème dépendant d'un hémophore. (Anne Lecroisey, Clarisse Deniau, Nicolas Wolff, Joël Couprie, Claire Castagné)

L'hémoprotéine HasA, 187 acide aminés, sécrétée en condition de carence en fer par la bactérie gram-négative Serratia marcescens permet à celle-ci de croître en fixant l'hème libre ou lié à une hémoprotéine. Elle est sécrétée par la voie ABC dépendante et possède un signal de sécrétion C-terminal. Après avoir étudié la structure du signal de sécrétion de HasA et déterminé les propriétés physicochimiques de HasA nous avons déterminé les structures de la protéine en absence d'hème en solution par RMN et de la protéine en présence d'hème par diffraction des rayons X (collaboration Unité de Physiologie Cellulaire, Cécile Wandersman et laboratoire Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques Marseille, Richard Haser). La structure tridimensionnelle de l'holoprotéine montre que celle-ci représente un type nouveau de repliement et que l'hème est fixé par une histidine et une tyrosine. Trois autres protéines partageant plus de 50% d'homologie avec HasA ont été récemment identifiées chez des bactéries associées à des maladies infectieuses humaines: HasApa (Pseudomonas aeruginosa), HasApf (Pseudomonas fluorescens) et HasAyp (Yersinia Pestis). Ces protéines sont également sécrétées par un transporteur ABC et ont une fonction d'hémophore. L'implication d'une protéine extracellulaire dans un système d'acquisition de l'hème n'avait jamais été décrite avant celle de la protéine HasA et les mécanismes de capture et de délivrance de l'hème de cette nouvelle famille de protéine sont encore totalement inconnus. Nous cherchons donc maintenant à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ce système original de captage de l'hème chez les microorganismes et le mode de fonctionnement de ces nouvelles protéines dont il semble, par ailleurs, exister un homologue chez l'homme

Structures de toxines de venins de scorpions (Ada-Prochnicka-Chalufour, Muriel Delepierre)

Les toxines extraites de venin de scorpions sont de petites protéines connues pour affecter la perméabilité aux ions des membranes des cellules. Outre le problème de santé publique posé par les piqûres de scorpions les protéines qui composent leur venin constituent des marqueurs spécifiques de nombreux systèmes biologiques et en particulier des sondes moléculaires pour l'étude des canaux ioniques. La connaissance de la structure de ces petites molécules devrait permettre d'appréhender la sélectivité pour les différents canaux ioniques mais aussi pour les différentes espèces. Dans ce sens nous avons déterminé la structure d'une toxine longue, Cn2 (Centruroides Noxius) très active sur les canaux sodium des mammifères, et de toxines courtes spécifiques des canaux potassium et possédant quatre ponts disulfures. (Collaboration Lourival Possani Mexique).

Etude structurale du domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase (Claire Castagné, Catherine Simenel, Ada-Prochnicka-Chalufour, Muriel Delepierre)

Certaines protéines qui fixent des acides nucléiques possèdent des régions qui, comme le domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase sont structuralement désordonnées et importantes fonctionnellement. Le rôle fonctionnel de ce désordre n'est pas encore compris.Le désordre pouvant être dynamique ou statique la RMN est la méthode de choix pour trancher. L'étude de la structure en solution du domaine C-terminal de la Tyr-tRNA marqué à l'azote-15 et au carbone-13 a montré que le désordre était statique et que ce domaine possédait une structure tertaire parfaitement définie (Collaboration H. Bedouelle Unité de Biochimie Cellulaire). Le domaine C-terminal de la TyrRS est de type a/b mais l'organisation de sa structure secondaire ne ressemble à aucun autre domaine de reconnaissance de l'anticodon connu pour le momment. Ces observations semblent aller dans le sens d'une nouvelle classe de domaine de reconnaissance de l'anticodon au sein de la famille des aminoacyl tRNA synthétases.

Structure de l'ADN et interactions ADN:proteine (Claire Castagné, Muriel Delepierre)

Les variations locales de la structure de l 'ADN peuvent jouer un rôle considérable dans les processus de reconnaissance en particulier avec les protéines. Bien que ces dernières années de gros progrès aient été réalisés pour essayer de comprendre les mécanismes et les bases moléculaires de la reconnaissance spécifique de l'ADN par les protéines, ce sont surtout les structures des protéines qui ont été abordées. En effet, une des difficultés majeures dans l'étude structurale des ADNs et des ARNs vient de la sous détermination du système, sous-détermination due à un manque d'information de distances pour définir la conformation du squelette. Nous avons voulu contourner cette difficulté en essayent d'obtenir ces informations via le noyau phosphore. Ainsi la structure fine du site kB du LTR du HIV a été étudiée par RMN du proton et du phosphore mais aussi par modélisation moléculaire (collaboration Brigitte Hartmann IBPC Paris), ainsi que les déformations de l'ADN dans les complexes ADN:SRY à l'aide des informations contenues dans les spectres phosphores (Collaboration Angela Gronenborn NIH Bethesda).

Etude structurale et dynamique de protéines à activité antipaludique (Inaki Guijarro)

L'une des approches possibles pour contrôler le paludisme est de produire des moustiques transgéniques réfractaires à l'infection par Plasmodium falciparum. L'expression, par des moustiques anophèles manipulés génétiquement, de peptides ou petites protéines parasiticides pourrait, en effet, éviter la transmission de la maladie. Une petite protéine à forte activité antipaludique, nommée NSLP ("Novel Shiva-Like Protein"), a été récemment isolée à partir de scorpions. NSLP inhibe totalement la formation des ookinètes parasitaires dans l'intestin de moustiques anophèles quand celle-ci est rajoutée au repas sanguin des moustiques à des concentrations de l'ordre du micromolaire. Aucun effet toxique sur le moustique n'est observé à ces faibles concentrations. La protéine NSLP se compose de soixante-quinze résidus. Sa séquence est connue et le gène correspondant a été cloné. Nous étudions par RMN la structure et la dynamique de NSLP en solution. Notre objectif est d'une part de comprendre le lien entre la structure (et la dynamique) de NSLP et son activité antiparasitaire, et d'autre part, de proposer sur la base de la structure déterminée, des mutations qui pourraient augmenter l'activité de la protéine.

Etude structurale de déterminants antigèniques reconnus par un anticorps monoclonal protecteur (Marie-Jeanne Clement, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Cette étude concerne des polysaccharides bactériens en relation avec le développement de vaccins synthétiques chimiquement définis afin de proposer une alternative au développement actuel de vaccins sous-unités basés sur l'utilisation d'antigènes polyosidiques. Le modèle d'étude est celui de l'infection par Shigella, une entérobactérie invasive, responsable chez l'homme de la dysenterie bacillaire ou shigellose et contre laquelle la nécessité d'un vaccin fait partie des priorités de l'OMS (collaboration avec Armelle Phalipon de l'Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Laurence Mulard et Françoise Baleux de l'Unité de Chimie Organique et Graham Bentley et Brigitte Vuilliez le Normand de l'Unité d'Immunologie Structurale). L'étude par RMN des interactions épitopes oligosaccharidiques/IgA et mimes peptidiques/IgA en solution devrait permettre à l'aide de technique de NOE transféré (TrNOE et TrROE) d'obtenir non seulement des informations conformationnelles mais aussi dynamiques lorsque les oligosaccharides ou les mimes peptidiques sont liés aux anticorps. Le but de l'étude est d'optimiser le choix de la structure " mime " soit sous forme peptidique ou sous forme osidique à partir de la connaissance à l'échelle moléculaire, du réseau des interactions mis en jeu dans la reconnaissance oligosaccharide/anticorps et mime peptidique/anticorps.

Méthodologie
(Muriel Delepierre)

Parmi les nombreuses méthodes spectroscopiques utilisées pour la caractérisation des molécules la RMN est de loin la moins sensible. Le manque de sensibilité de la méthode est une des raisons pour lesquelles les aimants supraconducteurs ont été développés et que des champs de plus en plus intenses sont utilisés. Une approche complémentaire et parallèle au développement des champs intenses consiste donc à optimiser les sondes afin d'en améliorer les performances et en particulier le rapport signal sur bruit pour pouvoir travailler avec des volumes plus faibles de l'ordre de 40microlitres. Nous avons montré d'une part qu'il était possible d'obtenir avec des nanomoles de composé des données comparables à celles obenues avec des sondes standards et, d'autre part, que certains problèmes de sensibilité liés à cette technoinolgie pouvaient être résolus.

Enseignement

Le laboratoire participe aux cours du magistère de Biologie Structurale de l'ENS, du cours Pasteur, du DEA de Biochimie des protéines (Paris VI et VII) et du DEA de Biophysique (Paris VI, VII XIII Orléans).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LOZANO Liliane

Tél. : 01 40 61 37 02

Fax : 01 45 68 89 29

Chercheurs de l'unité

DELEPIERRE Muriel, CNRS
GUIJARRO Inaki, IP
LECROISEY Anne, IP
WOLFF Nicolas, IP

Stagiaires de l'unité

CLEMENT Marie-Jeanne, Thèse
COUPRIE Joël, Post-doc
DENIAU Clarisse, Thèse

Autre personnel de l'unité

PROCHNICKA-CHALUFOUR Ada, IP
SIMENEL Catherine, IP

Publications de l'unité

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