Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunologie virale pour l'année 1999


Responsable : VIRELIZIER Jean-Louis (virelizi@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'unité d'Immunologie Virale analyse, dans deux infections virales humaines graves,le SIDA (virus VIH) et l'infection à cytomegalovirus (CMV), les moyens de défense de l'organisme, les moyens d'échappement des virus au controle immunologique,et les inflences réciproques entre les virus et les cellules infectées.En utilisant des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire, le laboratoire étudie le role de médiateurs solubles (chimiokines , interferon et TNF en particulier) dans le controle de l'entrée et de la transcription des virus dans leur cellules cibles, de façon systémique et au niveau des muqueuses.Les mécanismes moléculaires qui sont responsables de la latence et de la persistance virale, mais aussi les conséquences de la réplication virale, en particulier sur l'hématopoïese, sont étudiées. L'ensemble de ces enquêtes vise à mieux comprendre la relation entre l'hôte et les virus responsables d'infections persistantes, et à en déduire des moyens d'intervention virale nouveaux, appropriés aux stratégies virales ainsi disséquées.

Abstract

The laboratory of Viral Immunology analyses, in two models of persistent infection, AIDS (HIV) and cytomegalovirus (CMV), host defense mechanisms, viral escape mechanisms to immune responses, and the reciprocal influence observed between viruses and host cells.Using molecular and cellular biology methods, we investigate the role of soluble mediators (chemokines, interferon and TNF in particular)in the control of viral entry and transcription in target cells, both systemically and in mucosae. The molecular mechanisms responsible for latency and persistence, and also the pathological consequences of viral infection, especially on hematopoiesis, are investigated.Altogether these approaches aim at better understanding the relationship between hosts and viruses responsible for persistent infections, in order to suggest novel types of antiviral intervention adapted to the viral strategies thus delineated.

Texte du rapport

L’unité d’Immunologie Virale a poursuivi son étude des relations virus-cellules infectées, en les infléchissant en 1999 et 2000 vers l’analyse du rôle des médiateurs solubles, en particulier les chimiokines, et leur récepteurs, dans les moyens de défense de l’organisme contre les infections virales, et dans les désordres immunologiques et hématologiques induits par ces infections. Les deux virus étudiés ont été le VIH, agent du SIDA, et le cytomégalovirus humain (CMV), responsable de graves infections chez le nouveau-né et les sujets immunosupprimés. A- Rôle des médiateurs solubles (interferons, chimiokines) dans le contrôle des infections virales (Responsables: Susan Michelson et Fernando Arenzana-Seisdedos) Dans le but de renouveler les concepts et les outils dans le domaine des effecteurs de l’immunité antivirale, nous avons exploré les mécanismes non-cytolytiques, c’est-à-dire n’impliquant pas la destruction des cellules infectées, qui contrôlent, au moins in vitro, la réplication des deux virus étudiés au laboratoire. 1) Mécanisme des effets antiviraux de l’interféron gamma (IFN) sur la réplication du CMV. (Bodhagi et al, Journal of Immunology, 162,957,1999) Afin de rester aussi pertinents que possible vis-à-vis de la pathogénie de l’infection à CMV chez les patients immunosupprimés , chez qui l’atteinte la plus fréquente et grave de cette infection est la rétinite, responsable de cécité, nous avons mis au point des cultures de cellules épithéliales pigmentaires de la rétine humaine, où se réplique le CMV in vivo . Nos résultats indiquent que la suppression de la réplication du CMV dans ces cultures est profonde et permanente tant que l’IFN est maintenu, mais que le génome viral persiste dans ces cellules à l’état latent, et peut se réactiver lorsque l’IFN est retiré. Ces puissants effets antiviraux de l’IFN sont bloqués par l’addition de tryptophane en culture, et la transcription du gène de l’enzyme dont le tryptophane est le substrat, l’indoléamine dioxygénase (IDO), s’est révélée induite par l’IFN de façon clairement dépendante de la concentration d’IFN utilisée. Ces observations documentent un mécanisme insoupçonné , dépendant de l’IDO, responsable des effets inhibiteurs de l’IFN gamma sur la réplication du CMV, et permettent d’envisager que le contrôle de l’infection à CMV de la rétine par les lymphocytes T ne soit pas, ou pas seulement, dû à la destruction des cellules infectées, mais plutôt à la sécrétion d’IFN gamma et l’induction d’IDO, qui constitueraient des effecteurs essentiels de la " surveillance immune " contre l’infection virale. 2) Mécanismes des effets antiviraux des chimiokines sur la réplication du VIH. Il est désormais bien documenté que le VIH utilise, pour entrer par fusion dans ses cellules cibles, l’interaction de sa protéine d’enveloppe (gp160) avec deux molécules trans-membranaires : CD4, et un récepteur de chimiokine, essentiellement CCR5 ou CXCR4. Deux revues de notre laboratoire ont fait le point sur ce domaine de recherche évolutif (Virelizier, in Biological Characterization and Assay of Cytokines and Growth Factors,, Dev.Biol.Stand.Basel/, Karger, 97,105,1999 ; et Arenzana-Seisdedos, Eur.Cytokine Network, 10, 301, 1999). Bien que nos résultats précédents aient montré que l’endocytose de leur récepteur induite par les chimiokines sous-tend leur capacité de supprimer la réplication du VIH in vitro, de nombreux aspects de ce phénomène restent obscurs. Dans le cas de la chimiokine SDF-1, qui bloque l’entrée des virus utilisant CXCR4 ainsi que nous l’avions originellement montré, les types cellulaires responsables de sa sécrétion et leur localisation dans l’organisme étaient inconnus. Au contraire de ce qui est connu pour les chimiokines antivirales de type CC (RANTES et MIP-1), les lymphocytes normaux ou transformés ne produisent pas SDF-1. Afin de déterminer la nature et la localisation des cellules productrices de SDF-1, nous avons développé un monoclonal spécifique pour immuno-histo-chimie, et mis au point une technique d’hybridation in situ. Nos résultats sur des biopsies de peau humaine (Pablos et al, Am.J.Pathol/., 155, 1577, 1999) ont montré que les transcrits et la proteine SDF-1 sont exprimés dans les cellules épithéliales, mais pas les kératinocytes, et aussi les cellules endothéliales et les cellules dendritiques (cellules de Langherans). Ces dernières paraissent se traiter elles-mêmes de façon autocrine, puisque nous observons que ce type cellulaire à la fois produit la chimiokine et internalise CXCR4, le récepteur correspondant. Des résultats plus récents, qui seront publiés en 2000, ont été obtenus sur des biopsies de muqueuse humaine, confirment les données obtenues sur la peau, et y ajoutent l’observation d’un effet paracrine de la secrétion de SDF-1 par les cellules épithéliales sur l’internalisation in situ de CXCR4 au niveau des lymphocytes T muqueux. Globalement, ces observations sont compatibles avec l’hypothèse que la non expression membranaire de CXCR4 (alors que celle de CCR5 reste normale) peut expliquer que la contamination vénérienne par le VIH se fasse presque toujours par des souches R5 (utilisant CCR5), et non X4 (utilisant CXCR4), apportant ainsi une lumière nouvelle à ce phénomène bien connu mais incompris. Nous avons en outre analysé l’expression de SDF-1 chez l’embryon , et montré qu’elle caractérise les lignées épitheliales et mésothéliales , environnement critique de la différentiation des précurseurs de lymphocytes B.(Coulomb-L’herminé et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA/, 96, 8585, 1999). Les images obtenues in situ suggéraient que les cellules productrices de SDF-1 (expression cytoplasmique) exprimaient aussi la protéine sur leur membrane plasmatique. Nous avons testé l’hypothèse qu’un domaine de liaison à l’héparine était responsable d’une expression membranaire de SDF-1 par interaction avec les sulfates d’héparan . Nous avons pu en effet, en mutant spécifiquement trois résidus dans un cluster au niveau du premier feuillet béta de SDF-1 dont nous savions par nos travaux sur la structure 3D de SDF-1 qu’ils étaient exposés, montrer que la chimiokine s’associe aux sulfates d’héparan membranaires. Cette liaison est indépendante et non mutuellement exclusive de l’interaction avec CXCR4, mais son affinité reste inférieure (Amara et al, J.Biol. Chem., 274, 2396, 1999) . Ce travail suggère que la liaison de SDF-1 aux sulfates d’héparan permet aux cellules sécrétrices de constituer un réservoir membranaire de chimiokine prolongeant les effets autocrine et paracrine de SDF-1. La transcription du gène SDF-1 se fait sous le contrôle d’un promoteur contenant dans sa partie non-codante une région (3’A) dans laquelle une mutation a été décrite chez environ 4% des sujets Caucasiens. Cette mutation a été corrélée à une évolution retardée de l’infection VIH vers le SIDA avéré. Une étudiante de notre laboratoire a préparé sa thèse de sciences de l’université Paris VI, présentée depuis avec les félicitations du jury, à l’institut Pasteur du Cambodge, et a pu montrer que la fréquence de la mutation 3’A du gène SDF-1 dans la population Khmère était notablement supérieure à celle observée chez les Caucasiens, notion qui sera utile pour suivre l’évolution de l’épidémie d’infection VIH qui prend des proportions alarmantes dans ce pays (Rousset et al, AIDS, 13, 420, 1999).

B- Rôle des chimiokines dans le trafic des lymphocytes et des précurseurs hématopoïetiques.(Responsable: Fernando Arenzana-Seisdedos et Susan Michelson) Le rôle physiologique majeur des chimiokines est de contrôler le trafic de divers types cellulaires, et ceci est particulièrement clair vis-à-vis des cellules souches hématopoïetiques dans le cas de SDF-1, comme l’ont montré chez la souris l’inactivation du gène de cette chimiokine, et celle de son récepteur . Nous avons montré, en collaboration avec une équipe de l’institut Weissman (Israël), que SDF-1 induit l’expression des intégrines sur la membrane des endotheliums vasculaires in vitro, permettant ainsi l’adhésion et l’arrêt des précurseurs CD34 en condition de flot, condition nécessaire à l’extravasation des précurseurs vers la moêlle osseuse (Peled et al, J.Clin. Invest., 104, 1199, 1999). Le CMV semble aussi pouvoir interférer avec l’hématopoïèse en modulant la transcription du gène de SDF-1. Nos résultats préliminaires indiquent que la production de SDF-1 par des cellules du stroma (myo-fibroblastes médullaires purifiés à partir de prélèvements chez l’homme) est inhibée par la réplication in vitro du CMV, ce qui pourrait rendre compte des désordres hématologiques observés au cours des infections par ce virus.

C- Contrôle des fonctions du facteur de transcription NF-kB à travers la dégradation de l’inhibiteur IkB.(Responsables: Francoise Bachelerie et Fernando Arenzana-Seidedos) Notre laboratoire a continué à disséquer les évènements moléculaires responsables de la dégradation d’IkB , phénomène qui permet l’activation du facteur de transcription NF-kB. Nous avions précédemment montré que l’ubiquitination d’IkB, déclanchée par sa phosphorylation par des kinases spécifiques en réponse à des stimuli membranaires, était nécessaire au ciblage de l’inhibiteur sur le protéasome, qui dégrade la molécule. Nous avons maintenant rajouté l’observation que la molécule h-bTrCP, une protéine contenant un motif de boite F et représentant un type nouveau de ligase d’ubiquitine E3, est la protéine responsable de l’adressage d’IkBa vers le protéasome. La délétion du motif de boite F génère une molécule transdominante qui inhibe la dégradation d’IkB et l’activation de NF-kB (Kroll et al, J.Biol.Chem.,274 (12), 7941). Un autre travail (Renard et al, J.Biol. Chem, sous-presse 19 mai, 2000) a montré que l’activation de NF-kB, permanente tant que la stimulation par la cytokine TNF est maintenue, est due à la dégradation intranucléaire d’IkB par le protéasome. Ce phénomène abolit le phénomène de terminaison de l’activité nucléaire de NF-kB normalement exercé par IkB transloqué dans le noyau , et maintient l’activité transcriptionelle induite par le TNF aussi longtemps que la stimulation persiste.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Marie-Laure GOUPIL (goupil@pasteur.fr)

Chercheurs de l'unité

-Fernando ARENZANA-SEISDEDOS, directeur de recherche (farenzan@pasteur.fr) -Francoise BACHELERIE , chargée de recherche, fbachele@pasteur.fr) -Susan MICHELSON, directeur de recherche, (michelso@pasteur.fr) - Jean-louis VIRELIZIER, DRE,Pr. (virelizi@pasteur.fr)

Stagiaires de l'unité

AMARA Ali, stage post-doctoral
BEISSIER Patrick, stage post-doctoral
CARRUZ Antonio, stage post-doctoral
MAGERUS Aude, DEA
PERCHERANCIER Yann, Thèse
RENARD Patricia, stage post-doctoral
VALENZUELA-FERNANDEZ Agustin, stage post-doctoral

Autre personnel de l'unité

LAURENT Lysiane, technicienne
PLANCHENAULT Thierry, technicien

Publications de l'unité

En cas de problèmes ou de remarques concernant ce serveur Web, écrire à rescom@pasteur.fr. Cette page a été modifiée pour la dernière fois le Vendredi 5 Mai 2000 à 17 h 16 (Temps Universel) .