Rapport d'activité de l'unité Immunopathologie virale pour l'année 1999

CNRS URA 1930

Responsable : RIVIERE Yves (riviere@pasteur.fr)

Résumé du rapport

En réponse à une infection virale, l’hôte infecté élabore une réponse humorale et une réponse cellulaire spécifique de l’agent pathogène. En particulier, des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (LTC) restreints par le complexe majeur d’histocompatibilité détruisent les cellules infectées et sont responsables de l’élimination du virus ou du contrôle des infections virale persistantes. Chez les personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), une forte réponse LTC spécifiques est induite. Notre projet de recherche porte sur le rôle des effecteurs cytotoxiques spécifiques du VIH dans la pathogénèse des infections virales et en particulier de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) par plusieurs approches complémentaires: -Contrôle de la réplication virale par les LTC-CD8+: étude des mécanismes de l'inhibition de la réplication virale par les lymphocytes CD8+, in vitro. -Rôle des réponses cytotoxiques sur l'évolution de la maladie chez l'Homme infecté par le VIH: la réponse cytotoxique et l'évolution de la maladie chez les enfants infectés par le VIH. -Modèles animaux: infection du macaque par le virus de l'immunodéficience simienne ou SIV.

Abstract

Cell mediated immune responses are a major determinant in the pathogenesis of viral infections. The functions of antigen specific T lymphocytes are required for recovery from viral infections, for clearance of virus or control of persistent infection. On the other hand, an antiviral immune response may also result in immunopathology when an inflammatory response destroys cells infected by a relatively non cytopathic virus. Infection by the human immunodeficiency virus (HIV) results in a majority of cases, after a long incubation period, in the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The immunologic dysfunctions of AIDS, resulting from depletion of CD4+ lymphocytes for which HIV is tropic, have been well characterized, but little is known about protective immunity and the mechanisms of the pathogenesis of AIDS. A major goal of our group is to study the role of HIV-specific cytotoxic responses in the physiopathology of AIDS. In particular , our initial goal was to define the role of cytotoxic T lymphocytes (CTL) activities in HIV infection. We have focused our efforts in different directions 1- Role of CTL early in infection in pediatric AIDS infection, 2- CTL recognition of various HIV-1 clades, 3- Role of the 32bp deletion of CCR5 (*32) on disease progression in HIV-infected infants born to infected mothers. 4-Effect of treatment with a combination of reverse transcriptase and protease inhibitor agents on the CD8+ T-cell CTL functions recovery in treated children. 5-mechanism of control of HIV replication by CD8+ T lymphocytes. 6-animal models.

Texte du rapport

• Contrôle de la réplication virale par les LTC-CD8+ (S. Le Borgne, M. Février, G. Janvier): avec les outils que constituent les clones de lymphocytes cytotoxiques que nous avons caractérisés, nous avons évalué l'importance de la spécificité (antigénique) des clones dans le CRV (autrement dit est ce qu'un clone de LTC doit être spécifique du VIH pour contrôler la réplication du VIH?), et nous avons tenté de préciser le rôle des chimiokines et cytokines connues dans le CRV. L'activité inhibitrice de ces clones CD8+ était déterminée dans des conditions de coculture avec des lignées CD4 autologues et hétérologues infectées par un isolat utilisant le CXCR4 comme corécepteur (lymphotrope) d'une part, utilisant le CCR5 comme corécepteur (monotrope) d'autre part. L'importance de la spécificité de reconnaisance des LTC dans la spécificité de contrôle de la réplication virale a été étudiée, et nous avons pu exclure la lyse spécifique liée à l'activité LTC spécifique de VIH-1. De plus nous avons démontré qu'une lignée CTL , spécifique d'un virus autre que le VIH, et issu d'un donneur séronégatif pour le VIH, pouvait contrôler la réplication du VIH dans un système in vitro. Dans le cas de contrôle contre un virus lymphotrope "R5", les facteurs actifs du contrôle agisse à un niveau post-transcriptionnel (Le Borgne, Février, Callebaut, et Coll., 2000).
• Etude de Cohortes (E. Bui, F. Buseyne, B. Fleury, G. Janvier, F. Porrot). 1. La réponse cytotoxique et l'évolution de la maladie a été étudiée chez les enfants infectés par le VIH. Dix enfants (cinq à évolution rapide et cinq à évolution lente) ont été testés. Les LTC activés in vivo ne sont pas détectables chez les enfants à évolution rapide, mais sont présents de façon transitoire chez les enfants à évolution lente. Après stimulation in vitro, tous les enfants à évolution lente ont des LTC, et seulement deux des cinq enfants à évolution rapide. Au cours des six premiers mois de vie, la réponse cytotoxique n'est pas liée au profil d'évolution vers la maladie. Par contre entre l'âge de 7 à 12 mois, les enfants à évolution lente ont plus de réponse LTC que les enfants à évolution rapide. Par ailleurs, la charge virale est plus faible et le nombre de lymphocytes T CD4+ et CD8+ plus élevé chez les enfants ayant une réponse cytotoxique plus vigoureuse. Ces résultats sont en faveur d'un rôle bénéfique de la réponse LTC sur l'évolution de la maladie et montre pour la première fois un lien entre réponse cytotoxique durant la phase de primo-infection et l'évolution des symptômes cliniques chez l'enfant. 2. La diversité génétique du VIH-1 pose la question de son impact sur la spécificité de la réponse immunologique, en particulier des LTC, et de l'efficacité d'un éventuel vaccin. Un quart des mères infectées étant d'origine africaine et donc potentiellement porteuses d'isolats de différents sous-types, la détermination du sous-type ou clade de VIH-1 présent chez les enfants a été effectuée (collaboration avec le Pr. Rouzioux). Les activités LTC ont été étudiées sur 24 enfants, 15 infectés par le sous-type B 9 infectés par le sous type A, D, F ou G. Chez les enfants avec des activités cytotoxiques positives, les activités croisées étaient dominantes et étaient détectées dans 88% des cas contre la polymérase, dans 83% des cas contre nef, dans 67% contre gag et dans 55% des cas contre l'enveloppe. Nous avons montré une réactivité croisée importante des activités LTC spécifiques des différentes clades de VIH-1. Ce résultat démontre que l'infection par le VIH-1 induit une réponse LTC capables de reconnaître des isolats viraux dont les séquences génétiques divergent, ce qui est particulièrement important sur le plan vaccinal.
• Modèles animaux 1. Rôle des LTC dans l'infection primaire du macaque par le SIV (M. Février, en collaboration avec Bruno Hurtrel). Chez l'homme adulte, plusieurs groupes ont souligné le rôle potentiel des activités LTC, détectables avant les anticorps neutralisants, sur le contrôle précoce de la virémie au cours de l'infection primaire. La difficulté d'étudier avec précision la cinétique de l'infection humaine du fait de l'incertitude sur la date exacte de contamination et de la très grande difficulté d'investigation au niveau ganglionnaire en particulier, renforce l'intérêt de l'infection expérimentale du macaque par le virus de l'immunodéficience du singe ou SIV. Dans l'infection expérimentale du macaque rhésus, des activités LTC spécifiques du virus ont été mises en évidence dès les premiers jours de l'infection, et l'importance de la réplication virale (charge virale) initiale dans les ganglions après une infection primaire peut influer sur le développement de la maladie. Le but de notre projet est d'évaluer la relation entre la cinétique d'apparition des LTC et évolution, de même que la relation entre la cinétique d'apparition des LTC et la charge virale (PBMC et ganglion) au cours de l'infection primaire expérimentale du macaque par le SIVmac251. Nous avons étudié plus particulièrement la relation entre cinétique d'apparition des LTC et évolution vers la maladie, et entre la relation cinétique d'apparition des LTC et charge virale. Les résultats obtenus ont permis de montrer une relation inverse entre l’intensité des activités cytotoxiques et l’intensité de la charge virale et des marqueurs de l’immunodépression dans les premiers mois de l’infection par SIV (M. Février, B. Hurtrel et al., non publiés) 2. Efficacité de l'immunisation par ADN nu sur l'induction d'effecteurs cytotoxiques (S. Le Borgne, en collaboration avec Marie Louise Michel, UREG et Roger Legrand, CEA, Fontenay). Nous avons utilisé comme modèle pour optimiser un vaccin génétique soit l'ADN codant pour les protéines d'enveloppe du virus HBV soit de l'ADN codant pour des protéines hybrides HIV/HBV. Une épreuve virulente avec le virus SHIV (a été effectuée en vue de déterminer les conséquences de l'immunisation par l'ADN nu en particulier sur la charge virale et les signes cliniques. Chez les macaques témoins nous avons observé un diminution importante du nombre des lymphocytes CD4 accompagné d'une virémie plasmatique importante. Par contre chez les deux animaux immunisés par V3/HBs, la chute des CD4 était discrète et la charge virale moindre. De plus chez le macaque qui présentait le plus fort niveau d'activité LTC spécifique de l'enveloppe du VIH au moment de l'épreuve, la charge virale était 100 fois plus faible et le taux de lymphocytes CD4 normal. Ce résultat est en faveur d'un rôle de l'immunisation par injection d'ADN V3/HBs sur l'évolution de l'infection après épreuve virulente. 3. Importance de gène Nef dans l’expression du pouvoir pathogène chez le macaque infecté ( en collaboration avec B. Lafont, M.P. Kieny et A.M Aubertin, Strasbourg, et B. Hurtrel, Paris ). Nous avons suivi sur une période de plusieurs années des macaques rhésus infectés par 10 doses infectieuses du clone moléculaire SIVmac BK28-41. Ce clone a une délétion d'un nucléotide dans le gène nef ce qui conduit à l'expression d'une protéine nef tronquée. Compte-tenu de l'importance de l'intégrité de l'expression de la protéine nef dans l'expression du pouvoir pathogène des virus SIV et VIH, nous nous sommes intéressés à la variabilité dans la séquence du gène nef au cours de l'infection. L'insertion d'un nucléotide permet la restauration d'une phase de lecture ouverte et l'expression d'une extrémité C-terminale différente. Cette restauration est liée à une augmentation de la virémie cellulaire et à une augmentation du pouvoir pathogène chez le macaque. Ce résultat n'est pas en faveur de l'utilisation de VIH atténué comme vaccin (Lafont et Coll., Virology, 2000).

Mots clés : HIV, lymphocytes T cytotoxiques, charge virale, vaccination , ADSN, HBs/HIV.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

JEWIARZ Danielle, I.P. djewiarz@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

BUSEYNE Florence, I.P. florence@pasteur.fr FEVRIER Michèle, C.N.R.S. mfevrier@pasteur.fr RIVIERE Yves, I.P. riviere@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BUI Eida, Médecin Stagiaire
CATTEAU Adeline, D.E.A. acatteau@pasteur.fr LE BORGNE Sylvie, Thésard
SINGH Mandal PhD, Visiteur, USA. msingh@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

FLEURY Béatrice I.P. bgs@pasteur.fr
JANVIER Geneviève I.P. gjanvier@pasteur.fr PORROT Françoise I.P. sous contrat. fporrot@pasteur.fr

Publications de l'unité