Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunologie moléculaire des Parasites pour l'année 1999

CNRS URA 1960


Responsable : PUIJALON Odile (omp@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La thématique centrale de l’Unité est l’analyse des facteurs qui déterminent l’issue d’une infection palustre, avec comme but de développer un vaccin visant à prévenir la pathologie consécutive à une infection par Plasmodium falciparum. Nos efforts de recherche visent à identifier les paramètres qui orientent le système immunitaire vers une réponse protectrice ou pathologique ; à comprendre les conséquences du polymorphisme parasitaire dans les relations hôte/parasite ; à étudier les antigènes parasitaires et leur rôle développer un vaccin en utilisant des molécules conservées reconnues par les effecteurs de la clairance parasitaire. En1999, nous avons analysé l’activation des lymphocytes gamma delta chez l’enfant africain et entrepris une analyse détaillée du répertoire chez les enfants sains et les enfants en accès palustre. Nous avons approfondi l'analyse du déséquilibre TNFa/IL-10 dans l’anémie grave chez les jeunes enfants impaludés. Nous avons mis en évidence l’existence d’une considérable hétérogénéité géographique des populations parasitaires et montré que la grossesse est associée à une permissivité accrue à un grand nombre de souches, accompagnée d'infection par des génotypes particuliers. Nous avons fourni la première démonstration que P. falciparum est capable de traduire des messagers non canoniques, contenant un codon stop interne et montré que la famille polygénique Pf60 codait pour des antigènes localisés dans des compartiments cellulaires distincts. Nous avons étudié les réponses immunes, cellulaires et humorales, contre MSP1p19 chez des individus exposés à des conditions d'endémie différentes et poursuivi l’analyse des potentialités vaccinales des antigènes MSP1 et R23.

Abstract

The main research theme of the Unit is the analysis of factors which condition the outcome of an infection by Plasmodium falciparum, this with the goal to develop a vaccine aimed at preventing pathology. Our efforts are focused on 1) identifying the parameters which orient the immune system towards either a protective or a pathogenic response; 2) understanding the consequences of parasite polymorphism on host-parasite interactions; 3) studying parasite antigens and their function; 4) developing a vaccine using conserved antigens recognized by effectors of parasite clearance. In 1999, we have analyzed the activation of gamma delta lymphocytes in African children and initiated a detailed repertoire analysis in healthy children and in children suffering from a malaria attack. We further analyzed the TNFa / IL-10 secretion imbalance which prevails in young children suffering from severe anemia. Our analysis of diversity of field parasite populations has outlined the existence of a considerable geographical microheterogenity. We demonstrated that pregnancy was associated with an increased permissiveness to a large number of strains, associated with infection by particular parasite genotypes. We obtained the first demonstration that P. falciparum can translate non canonical messengers containing an internal stop-codon and showed that the Pf60 multigenic family codes for different antigens localized in distinct cellular compartments. We studied the antibody- and cell-mediated immune responses to MSP-1 19 in subjects exposed to different endemicity level and pursued the analysis of the vaccine potential of antigens MSP1 and R23.

Texte du rapport

La thématique centrale de l’Unité est l’analyse des facteurs qui déterminent l’issue d’une infection palustre, avec comme but de développer un vaccin visant à prévenir la pathologie consécutive à une infection par Plasmodium falciparum. Nos efforts de recherche visent 1) à identifier les paramètres qui orientent le système immunitaire vers une réponse protectrice ou pathologique ; 2) à mieux comprendre le rôle du polymorphisme parasitaire dans les relations hôte/parasite ; 3) à décrire les antigènes parasitaires et les mécanismes contrôlant leur expression ; 4) à développer un vaccin contre les formes sanguines asexuées, en utilisant des molécules conservées reconnues par les effecteurs de la clairance parasitaire. Cette année, nous avons particulièrement concentré nos efforts sur les points détaillés ci-dessous.

I. ANALYSE DES DESORDRES IMMUNOLOGIQUES ASSOCIES A L’INFECTION PALUSTRE 1. Analyse chez l’homme des désordres immunologiques associés aux infections aiguës et de leurs conséquences sur la pathologie (C.Behr, S. Loizon/ Coll L.Hviid, Danemark et D.Akanmori, Ghana). L’activation polyclonale des lymphocytes T joue un rôle important dans la physiopathologie de l’accès palustre. Nous nous intéressons en particulier aux sous-populations de lymphocytes T qui portent les chaînes gamma et delta du récepteur T. Nous avons montré que les lymphocytes T Vg9Vd2, qui habituellement sont en petit nombre, peuvent représenter jusqu’à 50 % des lymphocytes T CD3+ circulants chez des adultes européens en primo-infection. Ils constituent une source importante de cytokines pro-inflammatoires. Chez des enfants africains souffrant de paludisme grave (anémie grave ou neuropaludisme), il y a activation non seulement les lymphocytes T Vgamma 9 Vdelta2, mais également les lymphocytes Vdelta1. Les lymphocytes Vdelta 1 constituent la majorité des lymphocytes T gamma delta chez ces enfants, contrairement à ce qui est décrit chez des européens. Pour mieux cerner la nature de cette activation, nous avons entrepris une étude du répertoire des lymphocytes T gamma delta chez les enfants africains, en collaboration avec A. Lim (Unité d'immunologie moléculaire du gène). L'étude d'une cohorte contrôle d'enfants en bonne santé vivant dans la même zone, chez qui l'on observe aussi une forte prépondérance de lymphocytes T Vdelta 1, a montré que la chaîne Vdelta 1 n'est associée à aucune chaîne V gamma particulière. L’analyse par immunoscope des régions CDR3 indique qu'il n'y a pas de sélection oligoclonale de ces lymphocytes. L’analyse des répertoires des lymphocytes T gamma delta chez des enfants souffrant d’accès palustre est en cours. Parallèlement à l’étude des lymphocytes T, nous avons poursuivi l’analyse détaillée des taux de cytokines circulantes chez ces enfants souffrant d’accès grave. Nous avons montré que les deux complications majeures du paludisme, le neuropaludisme et l’anémie grave, correspondaient à deux syndromes distincts d’un point de vue immunologique, caractérisés par une balance TNF/IL10 différente. Le neuropaludisme correspondrait à un syndrome inflammatoire aigu où les taux élevés de TNF produits en réponse à de forte densités parasitaires, sont rapidement contre-balancés par une forte production d’IL10. En revanche, la production de TNF observée dans les cas d’anémie grave serait le résultat de l’incapacité du système immunitaire à produire des taux adequats de TNF en réponse à de fortes parasitémie, supprimant ainsi la régulation négative normale par l’IL10 et les récepteurs soluble du TNF. Ceci aboutirait à une production chronique de TNF à des taux modérés mais suffisants pour entraîner une dysérythropoïèse. Le rôle respectif des lymphocytes T, des NK et des monocytes/macrophages dans la régulation de la sécrétion de ces cytokines est en cours d’exploration.

2. Etude physiopathologique et immunopathologique de l’infection palustre dans le modèle d’infection expérimentale du singe Saimiri sciureus. (C. Behr, JC Michel / Collaboration H. Contamin, IPGuyane). De façon à pouvoir disséquer la cascade des évènements immunologiques conduisant à la pathologie, nous avons développé un modèle d’infection par un clone de P. falciparum chez le singe Saimiri non splénectomisé. Ce modèle mime dans ses aspects principaux la pathologie associée à l’accès simple chez l’homme : hyperthermie dépendante de la densité parasitaire, anémie transitoire et thrombocytopénie. La caractérisation d’outils immunologiques utilisables chez ce primate nous a permis d’analyser la cinétique d'activation des sous populations leucocytaires au cours de l'infection, en particulier des lymphocytes T gamma delta. Ceci indique que le Saimiri constitue un hôte-modèle pour l’étude du rôle biologique de ces cellules dans l’infection palustre.

II. ANALYSE DE LA DIVERSITE PARASITAIRE ET DE SES CONSEQUENCES BIOLOGIQUES Cinétique de mise en place de l’immunité protectrice, multiplicité des tableaux cliniques de paludisme, hétérogénité des situations épidémiologiques: autant de phénomènes dans lesquels la diversité parasitaire pourrait jouer un rôle majeur. Dans ce contexte, nous avons choisi d’analyser la diversité des populations parasitaires de terrain, de tenter d’identifier certains facteurs de virulence et d’étudier la modulation du phénotype parasitaire par certains facteurs de l’hôte. 1) Diversité parasitaire en zone d’endémie (O. Puijalon, D. Schleiermacher, F. Ariey) L’analyse des populations parasitaires et des caractéristiques des infections chez l’homme dans diverses conditions d’endémie est une étape nécessaire à l’élaboration de stratégies de lutte. Depuis plusieurs années, nous étudions le polymorphisme des populations parasitaires auxquelles sont exposés les sujets dont nous analysons par ailleurs les réponses immunes. Nous avons cette analysé par PCR la dynamique du portage de parasites pendant la saison sèche dans un village africain. Nous avons observé des changements importants dans les parasites hébergés par les porteurs chroniques, avec comme conséquence des modifications majeures des fréquences alléliques au sein de la population parasitaire à la saison de transmission suivante. Ceci indique que d'une année à l'autre les habitants d'un même village sont confrontés à des populations parasitaires différentes. L'infection par des parasites "nouveaux" est probablement une des causes des accès palustres lors de la reprise de la transmission. On sait que la grossesse accroît la sensibilité à l'infection par P. falciparum. L'analyse des caractéristiques des infections palustres chez les mêmes femmes africaines au cours et en dehors de la grossesse a montré que la grossesse est associée à une prévalence d'infections accrue, à des densités parasitaires plus élevées et à une plus grande multiplicité d'infection. Les multiplicités les plus élevées étant observées chez les plus jeunes femmes enceintes, il est difficile de dissocier l'effet de l'âge de celui de la parité. La grossesse et la parité ont une profonde influence sur la distribution de certains allèles des gènes msp1 et msp2. Ces résultats indiquent une permissivité accrue à un grand nombre de souches pendant la grossesse, accompagnée d'infection par des génotypes particuliers. L'analyse des populations parasitaires en Guyane française a mis en évidence une structure de population très particulière, avec un polymorphisme très restreint et un fort taux d'autofécondation. Ce type d'endémie contraste avec la plupart des situations africaines. Ces conditions sont particulièrement propices à l'étude de l'impact des génotypes parasitaires sur la gravité de l'infection. 2) Utilisation de la génétique réverse pour rechercher les facteurs de parasitaire de virulence. (S. Bonnefoy, M. Ball). Nous étudions la contribution de plusieurs facteurs à la pathologie dans le modèle expérimental P.falciparum/Saimiri sciureus. L’identification des déterminants parasitaires contribuant à la pathologie devrait permettre d’élaborer de nouvelles stratégies d’intervention ciblant spécifiquement les facteurs de virulence parasitaire. Cette étude est réalisée selon plusieurs approches distinctes faisant appel à l’utilisation de la génétique réverse . 3) Modulation par la rate de l'expression des antigènes de surface de l’érythrocyte infecté: recours au criblage de micro-réseaux d’ADN (P. David, O.Puijalon/ Coll. H. Contamin, C. Le Scanf IP Guyane; P. Rathod, Catholic University Washington; J. DeRisi, UCSF, USA). Nous avions montré que la rate modulait l'expression de certaines molécules parasitaires impliquées dans la variation antigénique et les propriétés de cytoadhérence des globules rouges infectés. Avec l'objectif d'identifier ces molécules, ainsi que les mécanismes de régulation de leur expression, nous avons choisi la stratégie de criblage de micro-réseaux (chips) d’ADN avec les cADN S+/S- préparés à partir des parasites isolés de singes intacts ou splénectomisés infectés par un même clone parasitaire.

III. ETUDE DES REPONSES IMMUNES ACQUISES CONTRE DES ANTIGENES PARASITAIRES 1) Analyse de la réponse immune contre les régions polymorphes de l'antigène MSP-1 (H. Jouin). L’analyse des réponses contre la région N-terminale polymorphe (bloc 2) de MSP-1 chez des individus vivant en zone d’endémie, dont nous avons par ailleurs typé les parasites, a permis d’observer une spécificité remarquable des réponses, chaque individu ne reconnaissant au mieux que quelques formes alléliques. La spécificité des anticorps n’est pas corrélée avec les allèles MSP-1 des parasites hébergés lors du prélèvement. Un suivi longitudinal indique que la réponse est figée sur quelques formes alléliques (spécifiques pour chaque donneur), suggérant un phénomène de “ clonal imprinting ”. 2) Etude de la réponse immune naturelle contre MSP1p19 (S. Longacre, en collaboration avec O. Garraud, IP Dakar). La stimulation in vitro des lymphocytes T provenant d'adultes immuns par des antigènes recombinants MSP1p19 produits par le baculovirus, S. cerevisiae ou E. coli a montré que les trois antigènes recombinants diffèrent dans leur capacité à stimuler les lymphocytes T. Ceci suggère que la conformation de cet antigène est un facteur critique de son interaction avec le système immunitaire. Nous avons établi les conditions de sécrétion in vitro d'IgG spécifiques par des lymphocytes B de donneurs immuns stimulés par la molécule MSP1p19 recombinante produite par le baculovirus. Cette sécrétion est effectuée en présence d'anticorps anti-CD40 et de cytokines (en particulier l'IL10), qui remplacent des signaux lymphocytaires T indispensables à l'activation et à la différenciation terminale des lymphocytes B. En revanche, les lymphocytes B des donneurs non-immuns ne produisent pas d'IgG spécifique. Ces données ouvrent la voie à l'analyse in vitro des facteurs qui favorisent la production d'anticorps IgG cytophiles (IgG1/IgG3), isotypes associés à la protection clinique. La sensibilisation in vitro de lymphocytes T de sujets n'ayant jamais été exposés à Plasmodium, par MSP1p19 recombinant a été réalisée, avec comme conséquence la sécrétion par les lymphocytes B homologues d'IgG spécifiques. L'IL-2 et l'IL-4 ont un rôle important dans la sensibilisation des lymphocytes T naïfs par MSP1p19. 3) Analyse de la réponse humorale contre la hsp70 (P. Dubois en collaboration avec F. Baleux, Unité de Chimie Organique ) Un système Multiple Antigenic Peptide comprenant un arbre de lysine “activé“ permettant le couplage de toute molécule comportant une fonction thiol (Cystéine dans le cas présent), par l’intermédiaire de la formation d’une liaison disulfure. Nous avions montré que l'immunisation à l'aide d'un MAP contenant un épitope cible d’anticorps médiant l'ADCC in vitro contre les hépatocytes infectés induisait une très forte réponse immune sur la protéine de P. falciparum correspondante, la heat shock protein PF72/Hsp70. Nous avons pu montrer cette année que l'utilisation de ce MAP en ELISA permet la détection d'anticorps spécifiques qui ne reconnaissent pas le peptide sous forme monomérique. Le polymère est fréquemment reconnu par les anticorps d'individus naturellement sensibilisés résidents de zone endémique, et de singes saïmiri infectés expérimentalement. La modélisation de la structure tridimensionnelle de Pf72/Hsp70, basée sur les données publiées sur la forme cristalline de la Hsp70 de E. coli, suggère que cette séquence peptidique est incluse dans une boucle bornée par un pont disulfure. Ceci suggère la présence d'un épitope conformationnel présenté par le MAP et non par le monomère. Ces données indiquent que le système MAP constitue un système intéressant non seulement pour l'immunisation, mais aussi pour la détection d'anticorps.

IV. ANALYSE DE LA FAMILLE POLYGENIQUE PF60/VAR (E. Bischoff, S. Bonnefoy, O. Puijalon). La famille Pf60, découverte dans notre laboratoire, comprend 140 membres, qui correspondent à au moins deux types de gènes : environ 50 gènes var codant pour l'antigène variant exposé à la surface du globule rouge parasité et des gènes Pf60 (en nombre encore indéterminé) codant pour des antigènes exprimés plus tardivement et associés au mérozoite. Nous avons caractérisé deux gènes Pf60, appelés 6.1 et 5.1. Nos données indiquent que les gènes Pf60 et les gènes var font partie de la même famille polygénique, comprenant des gènes ayant une région commune d'environ 1,5kb codant pour le domaine C-terminal, bien conservé entre les différents membres. Les protéines 6.1 et 5.1 sont associées à des compartiments cellulaires différents : noyau parasitaire pour 6.1 et membrane plasmique pour 5.1. Ces protéines n'ont pas d'homologie avec aucune protéine décrite à ce jour. La protéine 6.1 est donc un nouveau type de protéine nucléaire. Son rôle biologique serait de former un pont entre le cytosquelette nucléaire et l'ADN. Les mRNA 6.1 et 5.1 possèdent une structure non canonique, avec deux phases ouvertes de lecture séparées par un codon stop interne pour 6.1, ou dans deux phases de lecture différentes pour 5.1. Grâce à des anticorps dirigés contre différents domaines, nous avons pu montrer que les protéines correspondantes étaient produites par traduction colinéaire des deux phases de lecture. Ceci a été confirmé et quantifié par transfection transitoire de cultures parasitaires au moyen de plasmides dans lesquels le gène reporter de la luciférase avait été inséré au sein de la seconde phase de lecture. Il s'agit de la première démonstration que P. falciparum est capable de traduire des messagers non canoniques. Ceci ouvre une possibilité nouvelle d'intervention thérapeutique visant à interférer avec la traduction de ces protéines.

V. RECHERCHES VACCINALES
Avec pour objectif de développer un vaccin contre les formes sanguines asexuées, seules génératrices de pathologie, nous avons choisi d’explorer les potentialités vaccinales de deux antigènes: MSP1, composant majeur de la surface du mérozoïte et R23, antigène conservé, cible d’anticorps opsonisant l’érythrocyte infecté. 1) MSP1, cible vaccinale impliquée dans l’invasion de l’érythrocyte (S. Longacre, I. Holm; A. Manamperi) Nos objectifs sont 1) de déterminer de la fonction de la protéine majeure de surface du mérozoïte (MSP1) de Plasmodium par l’étude de sa structure, de son polymorphisme et de sa maturation; et 2) de poursuivre le développement de la partie C-terminale de MSP1 comme candidat vaccin. MSP-1 est une protéine de 200 kDa, ancrée par une liaison de type glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) à la surface du mérozoïte. Cette protéine polymorphe subit une maturation en deux étapes, aboutissant à un fragment C-terminal de 42kDa, lui même clivé pour aboutir à un fragment de 19 kDa, qui reste ancré à la surface du parasite au cours de l’invasion. Le polypeptide p19, qui est riche en cystéines, est bien plus conservé que le reste de la molécule. Les épitopes dépendant de la conformation de l'extrémité C-terminale sont impliqués dans la réponse immune protectrice dirigée contre le parasite Ainsi, des vaccins recombinants MSP1 reproduisant correctement ces épitopes complexes seront-ils vraisemblablement essentiels à l'induction d'une immunité protectrice. C’est pourquoi nous avons eu recours au système d'expression baculovirus / cellule d'insecte pour exprimer des protéines recombinantes correspondant aux p42 et p19 de P. vivax et P. falciparum et de P. cynomolgi. Ce dernier est une espèce très proche de P. vivax, infectant habituellement les singes macaques d'Asie du Sud-Est, mais il est aussi capable d'infecter l'homme. Ces caractéristiques font de P. cynomolgi un modèle intéressant pour tester le pouvoir protecteur de MSP-1 en vaccination dans un couple hôte/parasite naturel. En collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale, nous avons déterminé la structure cristalline de la MSP1p19 de P.cynomolgi produite par le baculovirus. Ceci a démontré l’existence de deux domaines EGF, prédits par l'analyse de séquence. Plusieurs essais de vaccination effectués avec les protéines recombinantes MSP-1 C-terminales sur des modèles primates ont été très prometteurs. Les essais cliniques sont le seul moyen de valider l'efficacité protectrice de ces candidats chez l'homme. En conséquence, nos efforts récents se sont concentrés sur les démarches nécessaires au transfert de la technologie à l'industrie, afin de préparer une molécule à usage humain. Ceci comprend trois objectifs: (1) la production et la purification des antigènes à l'échelle industrielle, de façon économiquement viable et dans des conditions acceptables pour un usage humain; (2) la caractérisation physique et immunologique des antigènes ainsi préparés; et (3) la démonstration chez les primates d'une immunogénicité et/ou une efficacité de protection avec ces antigènes en présence d'adjuvants utilisables chez l'homme. Nous avons atteint le premier objectif en collaboration avec l'OMS. Des efforts pour atteindre les objectifs (2) et (3) sont en cours, avec un soutien important de l'Union Européenne. 2) Analyse des potentialités vaccinales de l’antigène R23 (O. Puijalon, JC Michel en collaboration avec R.Perraut, IP Guyane) L’antigène R23 a été identifié comme la cible d’anticorps opsonisant les hématies parasitées par P. falciparum. Il dérive du gène R45, qui code pour une protéine présentant les motifs consensus des Serine Threonine Kinases. La région centrale de ce gène code pour un domaine répété comprenant environ 80 répétitions. L’antigène R23 est constitué de onze répétitions de 6 acides aminés dont le motif consensus est Asn His Lys Ser Asp Ser/His/Asn. Nous avions montré que chez le singe Saimiri sciureus, la Glutathion S transférase-R23 (GTR23) seule ou en mélange avec d’autres antigènes recombinants conservés, induit une bonne réponse protectrice, que ce soit chez des animaux pré-immuns , possédant un passé ancien d’infections palustres ou chez les animaux naïfs. Nous avons réalisé une expérience de vaccination dans laquelle nous avons injecté les répétitions R23 sans protéine porteuse en présence d’hydroxyde d’Alumine chez des singes pré-immuns. Nous avons observé une excellente protection contre une infection d’épreuve létale, protection corrélée avec la production d’anticorps de type cytophile. Ces données renforcent l'intérêt vaccinal de cet antigène.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LECUILLER Frédérique, I.P.

Chercheurs de l'unité

BEHR Charlotte, chargée de Recherche C.N.R.S. BONNEFOY Serge, chargé de Recherche I.P. DAVID Peter, directeur de Recherche C.N.R.S. DUBOIS Philippe, chef de Laboratoire I.P. LONGACRE Shirley, directeur de Recherche C.N.R.S. MICHEL Jean-Claude, chef de Laboratoire, Réseau I.P. PUIJALON Odile, chef de Laboratoire I.P.

Stagiaires de l'unité

BALL Maria, post-doctorale, Université de Mérida, Vénézuéla BISCHOFF Emmanuel, étudiant thèse, Université Paris 7 EKALA Marie-Thérèse, étudiante thèse, Université Paris 6 FAIVRE Valérie, adjointe technique, Université Paris 7 MANAMPERI Aresha, étudiante thèse, Université de Colombo, Sri Lanka O’MAHONY Kevin, étudiant maîtrise, Université de Genève REMERAND Francis, étudiant thèse, Université Paris 7 SCHLEIERMACHER Dietlind, post-doctorale, Université de Bonn, Allemagne

Autre personnel de l'unité

GUILLOTTE Micheline, technicienne supérieure, I.P. HOLM Inge, ingénieur position 1, I.P.
HUYNH QUAN DAT Myoura, technicienne supérieure, I.P. JOUIN Hélène, ingénieur position 3, I.P. KHOURI Elisabeth, assistante ingénieur, C.N.R.S. LOIZON Séverine, technicienne supérieure, I.P.

Publications de l'unité

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