Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunogénétique cellulaire pour l'année 1999


Responsable : THEZE Jacques (e.mail : jtheze@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’IL-2 est une cytokine majeure du système immunitaire. Elle interagit avec un récepteur (RIL-2) composé de trois sous-unités (alpha, béta et gamma). Ses fonctions principales sont d’assurer l’expansion clonale des lymphocytes T activés par l’antigène, mais aussi, de manière paradoxale, d’induire l’apoptose de ces cellules afin de limiter la réponse immune. Nous abordons des questions d’ordre fondamental comme la détermination des gènes spécifiquement induits par l’IL-2 et l’étude d’un mimétique de l’IL-2. En immunopathologie humaine, nous étudions la dérégulation du système IL-2/RIL-2 au cours de l’infection par le VIH.

Abstract

Interleukin-2 (IL-2) is a main cytokine of the immune system. The IL-2 receptor (IL-2R) comprises three chains. In addition to its role in the expansion of Ag-activated lymphocytes, IL-2 is also able to induce cell death (Activated Induced Cell Death). Signal transduction triggered by IL-2 is complex and involves three major pathways .We currently analyse these pathways by the use of IL-2 mimetics that interact with only one subunit of the IL-2R. Using substraction cDNA libraries and RNA display, we describe new IL-2-induced genes and we study their expression in IL-2 knock-out mice. The regulatory dysfunction of the IL-2/IL-2R system during HIV-infection and the impact of triple combination therapies on this system is also investigated.

Texte du rapport

Mode d'action de l'IL-2 : contrôle de l'équilibre activation/apoptose (P. Chastagner, J. Reddy)

Jusqu'à présent, seuls quelques gènes cibles de l'IL-2 étaient connus : les proto-oncogènes c-myc, c-jun, c-fos et bcl-2 qui sont activés par un grand nombre de cytokines, et plus spécifiquement la chaîne alpha du récepteur de l'IL-2. Concernant le gène RIL-2alpha nous avons confirmé in vivo, en comparant les souris IL-2-/- et IL-2+/-, qu'il est spécifiquement induit par l'IL-2 au niveau des organes lymphoïdes secondaires alors que son expression est indépendante de l'IL-2 dans le thymus et la moelle osseuse. Par ailleurs nous avons montré que le gène du TNF-béta est spécifiquement induit par l'IL-2 par l'intermédiaire de la voie Jak/STAT. Plus précisément, le facteur de transcription STAT5 est activé et se fixe sur une séquence activatrice (GAS) en amont du gène du RIL-2alpha. Afin d'identifier de nouveaux gènes cibles nous avons construit une banque différentielle, grâce à une même cellule poussant en IL-2 ou en IL-4, qui nous a permis d'isoler de nombreuses séquences. Parmi celles-ci, certaines correspondent à des gènes impliqués dans la régulation du cytosquelette ou codent pour des oncogènes et des facteurs de transcription. La spécificité vis-à-vis de l'IL-2 a été vérifiée in vivo pour certains d'entre eux. Récemment il a été montré que l’IL-2 peut induire l’apoptose des lymphocytes. Cette fonction est sans doute la plus importante in vivo puisque chez les souris IL-2-/-, on observe une prolifération lymphocytaire incontrôlée menant à des manifestations auto-immunes. Dans le but d'en déterminer les mécanismes, nous étudions des gènes induits par l'IL-2 et qui seraient liés au contrôle du processus d'apoptose.

Caractérisation d’un nouvel agoniste du RIL-2b (R. Eckenberg,, E. Assier, J-L. Moreau)

Dans le cadre d’une étude structure-fonction de l’IL-2, nous avons caractérisé un nouvel agoniste de la chaîne b du RIL-2, le peptide p1-30. Ce peptide contient les 30 premiers résidus de l’IL-2. Dans le but d'élucider les mécanismes d'action de cette nouvelle molécule, nous avons étudié ses propriétés physico-chimiques et biologiques. L'étude de sa structure secondaire et quaternaire en solution montre qu'il se replie en hélice a et qu'il forme un tétramère. Le peptide, seul, induit une prolifération des cellules TS1b (lignée murine T CD4+ transfectée avec RIL-2b humain) et Kit 225 (lignée leucémique T humaine CD4+). En combinaison avec l'IL-2 mais aussi avec l'IL-4, l'IL-9 et l'IL-15, une synergie est observée. L'activité biologique du peptide nécessite une interaction avec le RIL-2b humain. En effet, un anticorps anti-b humain (neutralisant l’IL-2) inhibe les effets de p1-30. De plus le peptide n'est actif que sur des lignées cellulaires exprimant la chaîne humaine du RIL-2b. Par contre, l'activité de p1-30 est indépendante des autres chaînes du RIL-2 (a et g). Les signaux de transduction induits par p1-30 ont été étudiés. Comme l'IL-2, p1-30 provoque la phosphorylation de la protéine adaptatrice SHC ainsi que l'activation de la protéine kinase p56lck. Dans le système IL-2/RIL-2, ces deux protéines sont spécifiquement recrutées par le RIL-2b. Contrairement à l'IL-2, p1-30 ne permet pas l'activation des protéines STATs, ni la phosphorylation des kinases Jak1 et Jak3, alors qu'il induit la phosphorylation de la kinase Tyk2. Au niveau de l’induction génique, p1-30 active la synthèse de la protéine bcl-2 et une induction synergique des proto-oncogènes c-myc, c-jun et c-fos est observée en présence d’IL-2, ce qui pourrait expliquer la synergie observée au niveau de la prolifération. Enfin, l'activité de p1-30 a été testée sur les PBMCs. Il induit leur prolifération et augmente leur activité cytotoxique (induction de cellules LAK "Lymphokine-activated killer" mesurée sur les cibles cellulaires K562 et Daudi). De plus, p1-30 induit la production d'IFNg dans le surnageant des PBMCs. Afin de discerner les sous-populations activées par p1-30, nous avons suivi l'expression du marqueur précoce d'activation CD69. Après stimulation par p1-30, ce marqueur est spécifiquement exprimé sur les sous-populations NK et CD8low qui sont principalement impliquées dans les phénomènes cytotoxiques et qui expriment spontanément la chaîne b du récepteur de l'IL-2. Ce travail s'inscrit dans le cadre général de la caractérisation de mimétiques des cytokines. Le but étant de mieux comprendre l'action de ces molécules et de rechercher des produits plus actifs ou dépourvus d'effets secondaires. Dans le domaine de l'IL-2, le peptide p1-30 est la seule molécule à s'inscrire dans ce cadre.

Implication de l’IL-2 et de son récepteur dans l’immunopathologie liée à l’infection par le VIH (D. David, H. Keller, V. Mazard, L Bani, M. Kryworuchko)

L'expression des trois chaînes du RIL-2, sur les différentes populations lymphomonocytaires du sang en situation non pathologique, a été analysée. Deux profils d'expression du RIL-2 sont révélés ex vivo : les cellules impliquées dans les réponses spécifiques comme les lymphocytes (L) T CD4, T CD8 et les L B n'expriment pas à leur surface les chaînes du RIL-2 ; les cellules impliquées dans les réponses non spécifiques, expriment de manière très abondante soit la chaîne béta (cellules NK) soit la chaîne gamma (monocytes). Concernant, la chaîne gamma, nous avons montré que son ARNm est transcrit constitutivement et que la protéine est présente dans le compartiment intracellulaire pour les cellules T CD4, CD8, NK et les L B. La sensibilité des lymphocytes à l'IL-2 corrèle avec l'expression du RIL-2 : en effet, seules les cellules NK répondent à l'IL-2. Chez les patients séropositifs au VIH, l'infection se traduit par une forte expression des trois chaînes du RIL-2 sur les LT CD8 et sur les L B. L'expression est aussi augmentée sur les monocytes. A l'opposé, les LT CD4 n'expriment que peu le récepteur à l'IL-2. Comme chez les sujets sains, les cellules NK expriment normalement la chaîne béta. En plus de cette dérégulation dans l'expression du RIL-2, la réactivité à l'IL-2 est aussi perturbée. A l'exception des L B qui sont très réactifs à l'IL-2, les L T ne répondent que marginalement et la réactivité des NK est diminuée. Chez un groupe de patients qui répondent bien à la trithérapie (augmentation du taux de L T CD4, disparition de la charge virale détectable), on note une normalisation partielle de l'expression du RIL-2 sur l'ensemble des populations. Pour les L B, ceci va de pair avec une diminution de la réactivité à l'IL-2. Au contraire, les L T CD4 et les L cytotoxiques (T CD8 et NK) sont plus réactifs à l'IL-2. Ces résultats suggèrent donc qu'une thérapie incluant l'IL-2 pourrait aboutir à une augmentation plus importante des L T CD4 ainsi qu'à une diminution des réservoirs viraux qui persistent sous trithérapie. Actuellement nous étudions l'expression du RIL-2 et la réactivité à l'IL-2 des L T CD4 d'un groupe de patients qui ne remontent pas leur taux de CD4 malgré une disparition de la charge virale plasmatique, un traitement de ces patients par de l’IL-2 est en cours.

MOTS CLES

Interleukine-2, Récepteur de l’interleukine-2, Apoptose, Peptide Mimétique, VIH

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

COREL Christiane

Chercheurs de l'unité

THEZE Jacques (IP)

Stagiaires de l'unité

ASSIER Eric, Post-Doc
BANI Lynda, Post-Doc
DAVID Denis, Post-Doc
ECKENBERG Ralph, Etudiant en thèse
KRYWORUCHKO Marko, Post-Doc
MAZARD Virginie, Etudiante en thèse
REDDY Jay, Post-Doc

Autre personnel de l'unité

CHASTAGNIER Patricia, Technicienne
KELLER Hélène, Technicienne
MOREAU Jean-Louis, Ingénieur

Publications de l'unité

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