Rapport d'activité de l'unité Interactions Bactéries-Cellules pour l'année 1999

Responsable : Cossart Pascale (pcossart)

Résumé du rapport

Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, une bactérie responsable d'infections alimentaires graves et qui est devenue un système modèle pour comprendre le parasitisme intracellulaire ainsi que l'exploitation des fonctions cellulaires par les pathogènes. L. monocytogenes est responsable de septicémies, de méningites et d'avortements chez l'homme et certains animaux. La mortalité est élévée: 30%. Les sujets à risque sont les individus au système immunitaire faible (nourissons, personnes agées) ou affaibli(par des maladies ou des traitements immunosuppresseurs) ainsi que les femmes enceintes. Listeria monocytogenes se caractérise par sa capacité à traverser des barrières normalement trés étanches: la barrière intestinale, la barrière hémato-encéphalique et la barrière foeto-placentaire. Dans les tissus qu'elle infecte, Listeria est en position intracellulaire. In vitro, Listeria est aussi intracellulaire car elle entre dans de nombreux types cellulaires et s'y multiplie. Aprés lyse de la vacuole de phagocytose, les bactéries en même temps qu'elles se répliquent, se déplacent dans le cytosol et passent de cellule en cellule en utilisant un mécanisme de propulsion trés original généré par une polymérisation de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. Notre activité a en 1999 porté essentiellement sur plusieurs aspects de l'entrée dans les cellules, l’analyse des vacuoles de phagocytose, l'étude des mouvements intra- et intercellulaires, la régulation de l'expression des gènes de virulence, l'identification de nouveaux gènes de virulence, et la détermination des séquences des génomes de L. monocytogenes et de L. innocua.

Abstract

Our Unit is studying the molecular and cellular basis of the pathogenicity of Listeria monocytogenes, a bacterium which is responsible for severe food borne infections and which has become a model system for the study of intracellular parasitism and the exploitation of cellular functions by pathogens. L. monocytogenes is responsible for septicemias, meningitidis and abortions in man and animals. It has the capacity to cross the intestinal barrier, the blood brain barrier and the foeto-placental barrier. In all infected tissues, L. monocytogenes is intracellular. In vitro, Listeria is also intracellular because it enters into many cell types and replicate therein. After lysis of the phagocytic vacuole, bacteria move inside the cytosol and spread from cell to cell using a spectacular phenomenon of propulsion generated by a phenomenon of actin polymerisation at one of the two bacterial poles. Our activity in 1999 has focused on several aspects of bacterial entry into mammalian cells, on the study of intra- and intercellular movements, on the regulation of virulence gene expression, on the identification of new virulence genes and on the determination of the sequences of the genomes ofListeria monocytgenes and L. innocua.

Texte du rapport

I Entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules de mammifères ( H. Bierne, L. Braun, S. Dramsi, C. Dupuy, R. Hurme, R. Jonquières, et M. Lecuit) Nous avons poursuivi l'étude de deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée dans les cellules, l'internaline (ou InlA) et InlB. Ces deux protéines se distinguent par le fait que l'une, l'internaline est impliquée dans l'entrée dans un nombre restreint de cellules, alors que l'autre, InlB est utilisée pour l'entrée dans toutes les cellules.

1. L'internaline et son récepteur, la E-cadhérine, un exemple de spécificté étonnant Le récepteur de l'internaline avait été identifié par chromatographie d'affinité. Il s'agit de la E-cadhérine. Nous venons de montrer que l'internaline interagit avec la E-cadhérine humaine, celle de poulet ou celle de cobaye mais pas avec la E-cadhérine murine et que l'acide aminé critique pour cette spécificité est l'acide aminé 16. Ces résultats expliquent pourquoi aucun rôle in vivo n'avait été jusqu'ici été démontré pour l'internaline en utilisant le modèle d'infection qu'est la souris. Nous analysons la fonction de l'internaline dans le modèle cobaye. Nous avons aussi en collaboration avec C. Babinet (Unité de Biologie du développement), créé des souris transgéniques exprimant la E-cadherine humaine. Les infections sont en cours. Nous avons aussi analysé la façon dont la E-cadhérine permet l’entrée dans les cellules en générant des lignées de fibroblastes exprimant des E-cadhérines variantes, c’est à dire portant différentes délétions du domaine cytoplasmique. Nos résultats indiquent que seule la région d'interaction avec la b-caténine est critique pour l'internalisation de la bactérie. 2. La protéine InlB
2. Attachement d'InlB aux acides lipotéchoiques de la bactérie Nous avons montré qu'InlB est associée d’une façon labile jamais décrite jusqu’alors, avec la surface de la bactérie. Cette association s'effectue par la partie C-terminale qui est composée de motifs répétés de 80 acides aminés commençant par le dipeptide GW. Ce domaine interagit de façon non covalente avec les acides lipotéchoiques de la bactérie, que la proéine soit produite par la bactérie ou qu'elle soit ajoutée de façon exogène.
3. Structure tridimensionnelle d'InlB (collaboration avec P. Ghosh, UCSD, Califormia) La partie N-terminale de la protéine InlB (les 213 premiers acides aminés comprenant des régions répétées en tandem riches en Leucine ou LRRs) a été cristallisée et la structure tridimensionnelle déterminée à une résolution de 1.86 A. La protéine a la forme d'un tube allongé qui permettrait la formation d'un complexe multiprotéique. Cette structure révèle qu'InlB peut fixer deux ions calcium qui serviraient de pont entre la bactérie et son récepteur. Des travaux de mutagénèse sont en cours pour tester l'hypothèse du rôle des sites de fixation au calcium dans la fonction d'InlB.
4. Le récepteur d'InlB, le gC1qR Par une technique de chromatographie d'affinité, nous avons identifié une protéine ubiquitaire qui se fixe à InlB et permet l'entrée dans les cellules de mammifères. Il s'agit du récepteur de la forme globulaire du C1q, le premier composant de la cascade du complément . Cette protéine n’ayant pas de domaine transmembranaire ni de domaine intracytoplasmique, nous pensons qu’il existe un co récepteur que nous recherchons.
5. La signalisation lors de l'entrée: activation de la PI3-kinase, de la PLC-g1 et de NF-kB En utilisant la protéine InlB purifiée, nous avons démontré que celle ci peut activer la PI 3- kinase en stimulant la phosphorylation de trois protéines adaptrices, Gab1, Cbl et Shc. InlB est la première protéine bactérienne capable d'activer la PI 3-kinase. De façon étonnante, alors que les bactéries entrent dans les cellules sans produire d'importants réarrangements du cytosquelette d'actine, InlB soluble produit des replis membranaires et une polymérisation spectaculaire de l'actine. Nous analysons les mécanimes permettant ces réarrangements par plusieurs approches. L'une d'entr'elles a été d'identifier les cibles des produits de la PI 3-kinase. Nous venons de démontrer qu'elle active la PLC-g avec production d'IP3 qui à son tour induit un relargage du calcium à partir des stocks intracellulaires. L'infection de cellule PLC-g-/- démontre que la PLCg n'a pas de rôle au moment de l'entrée mais doit servir à des évènements plus tardifs. InlB apparait comme une molécule trés importante dans la signalisation car elle est aussi capable d'activer NF-kB notamment dans les macrophages.

II. Identification des molécules spécifiques des phagosomes contenant L. monocytogenes. (J. Pizarro-Cerda)
Afin d’identifier les molécules clés pour l’internalisation de L. monocytogenes dans les cellules, nous avons pris une approche de type protéomique et avons entrepris d’analyser la composition protéique et lipidique des vacuoles d’internalisation. Les vacuoles sont isolées par fractionnement subcellulaire aprés interaction des cellules avec soit L. monocytogenes, soit L. innocua exprimant l’internaline ou InlB soit des billes de latex recouvertes d’internaline ou d’InlB. La composition protéique de ces phagosomes est analysée après electrophorèse en gels bidimensionnels par des techniques combinant entre autres Western blotting et spectrométrie de masse.

III. Les mouvements intracellulaires et inercellulaires actine-dépendants. (V. David, P. Dehoux, E. Gouin, P. Steffen et V. Villiers)

1. Motilité de Listeria monocytogenes Nos travaux cherchent à comprendre comment la protéine bactérienne ActA intervient dans la polymérisation de l'actine. En testant l'hypothèse qu'ActA pourrait protéger les extrémités barbées des filaments d'actine, nous avons découvert qu'ActA fixe le phospholipide PIP2. Le rôle de cette interaction est inconnu. Par ailleurs, par une approche génétique couplée à une approche biochimque menée en collaboration avec MF Carlier à GIF sur Yvette, nous analysons l'interaction d'ActA avec le complexe Arp2/3, complexe considéré à l'heure actuelle comme le nucléateur universel de la polymérisation de l'actine et qui a besoin d'être activé pour être fonctionnel.
2. Motilité de Rickettsia conorii Afin d'appréhender différemment le phénomène de mouvement intracellulaire couplé à la polymérisation de l'actine, nous avons comparé les motilités actine-dépendantes de Shigella flexneri, de Listeria avec celles de Rickettsia conorii, une bactérie intracellulaire responsable de fièvres éruptives et véhiculée par des tiques. Nous avons découvert que R. conorii semble utiliser un mécanisme complétement différent de celui utilisé par Shigella et Listeria. Les filaments d'actine polymérisés par la bactérie sont longs, non branchés et fixés sur la bactérie. Par ailleurs, il a été impossible de détecter le nucléateur considéré comme universel à l'heure actuelle, le complexe Arp2/3. La séquence du génome de R.conorii est en cours de détemination au Génoscope d'Evry. Les données actuelles ont fait apparaître un gène candidat pour être impliqué dans la motilmité actine dépendante dont nous essayons d'analyser la fonction.

IV. Régulation de l'expression des gènes de virulence (A. Renzoni, S. Dramsi)
Nous avons montré que la protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L. monocytogenes. L'expression de cette protéine est complexe. Nous avons montré que dans certaines conditions environnementales où les gènes de virulence sont réprimés, la protéine peut être présente mais inactive. Nous venons de montrer que l'expression de la protéine est augmentée en présence des cellules hôtes ou même en présence d'extraits cellulaires. Nous recherchons le(s) signal(aux) cellulaires responsables de cette induction. Les données du génome nous ont permis d'identifier d'autres cibles potentielles que nous analysons actuellement.

V. Identification de nouveaux gènes de virulence ( H. Fsihi)
Pour identifer de nouveaux gènes de L. monocytogenes indispensables à sa survie et à sa prolifération in vivo dans le modèle expréimental murin, nous avons pris une approche génétique appelée mutagénèse STM ou "Signature-tagged mutagenesis'. Nous avons construit une banque de mutants de L. monocytogenes étiquetés à l'aide de 96 transposons différents, qui sont utilisés pour infecter des souris; par une identification des mutants présents dans l'inoculum initial et absents dans les tissus aprés plusieurs jours d'infection autrement dit, incapables de survivre chez la souris, les gènes requis pour la virulence in vivo sont identifiés. L'utilisation de plusieurs lots de mutants étiquetés différemment permet un criblage simultané d'un grand nombre de mutants dans un nombre réduit d'animaux. Nous avons identifié plusieurs mutants qui sont en cours d'analyse.

VI. Séquence des génomes de L. monocytogenes et L. innocua et analyse post génomique ( P. Dehoux, O. Dussurget, H. Fsihi)
En collaboration avec le laboratoire de génomique des pathogènes (en particulier, P. Glaser, C. Buchrieser et L. Frangeul), nous participons à l'analyse, annotation et comparaison des génomes de L. monocytogenes et L. innocua, une espèce non pathogène du genre Listeria.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

MATUSZEWSKI Marie-Hélène

Chercheurs de l'unité

Chercheurs permanents
BIERNE Hélène, CR1 INRA
DAVID Violaine, CR2 INSERM (départ juin 2000) DRAMSI Shaynoor, CR IP
FSIHI Hafida, Assistante IP
Khelef Nadia, CR IP (arrivée septembre 2000)

Stagiaires de l'unité

BOURDICHON François, DEA
DUSSURGET Olivier, Boursier Roux
CABANES Didier, Stagiaire post-doctorant CEE Johansson Jorge, Stagiaire post-doctorant EMBO (arrivée septembre 2000) JONQUIERES Renaud, Etudiant en Thèse
LECUIT Marc, Etudiant en Thèse
PIZARRO-CERDA Javier, Stagiaire Post-Doctorant ARC RENZONI Adriana, Stagiaire Post-Doctorant CEE (depart octobre 2000)

Autre personnel de l'unité

DEHOUX Pierre, Ingénieur IP
GOUIN Edith, Ingénieur IP
VILLIERS Véronique, technicienne IP

Publications de l'unité